In Vitro Nuclear Assembly Met behulp van Gefractioneerde Xenopus Egg Extracten
2 september 2008
Kernmembraan assemblage is een essentiële stap in de celdeling-cyclus, dit proces kan worden gerepliceerd in de proefbuis door het combineren van Xenopus sperma chromatine, cytosol, en licht membraan fracties. Compleet kernen worden gevormd, met inbegrip van nucleaire membranen met poriën complexen, en deze gereconstitueerde kernen zijn in staat van normale nucleaire processen.
Xenopus labus-ei-extracten zijn nuttig als cytoplasmatisch en organelmateriaal voor de in vitro reconstitutie van cellulaire processen, zoals kernassemblage en import van kernproteïnen. Wanneer spermachromatine-DNA wordt toegevoegd aan ruwe of gefractioneerde XUS-ei-extracten, binden membraanvesikels die in het extract aanwezig zijn zich aan het oppervlak van het chromatinen, fuseren zij en incorporeren zij componenten van de kernporie om volledig functionele synthetische kernen te vormen. De karakterisering van de moleculaire basis van deze processen is vervolgens mogelijk door immunodepletie van extracten en door proteïne-editie.
Hoi, mijn naam is Marie Cross en ik ben een promovendus in het laboratorium van Dr. Maureen Power van de afdeling Celbiologie aan de Emory University in Atlanta, Georgia. Vandaag laten we u zien hoe u in vitro kernen kunt vormen met behulp van gefractioneerde xenopus-eiextracten. Deze procedure omvat de volgende stappen: het uitvoeren van de reactie voor kernassemblage en het beoordelen van de kernvorming.
Laten we beginnen. Om de nucleaire assemblage te starten, neemt u een aliquot gefractioneerd cytosol en voegt u fosfocreatine uit een 0,2 molar voorraadoplossing toe tot een eindconcentratie van 20 millimolar. Voeg vervolgens creatinekinase uit een voorraadoplossing van vijf milligram per milliliter toe tot een eindconcentratie van 50 microgram per ml.
Voeg ten slotte 20 micromolaire A TP toe met behulp van een 0,2 molaire voorraadoplossing. Voeg vervolgens lichte membranen toe aan het cytosol in een verdunning van één op 10. Dit benadert de hoeveelheid membraan die aanwezig is in het oorspronkelijke ruwe extract.
Meng alle componenten door herhaaldelijk op en neer te pipetteren om de membranen in het extract te dispergeren. Dit moet gebeuren voordat het spermachromatine wordt toegevoegd. Voeg vervolgens spermachromatine in de gewenste concentratie toe aan het gefractioneerde extract en meng het extract en het sperma onmiddellijk door voorzichtig op en neer te pipetteren met een afgeknotte tip.
Wanneer het spermachromatine aan het extract wordt toegevoegd, begint het onmiddellijk te decomprimeren, te condenseren en gevoelig te worden voor afschering. Over het algemeen worden deze reacties uitgevoerd in centrifugebuisjes van 500 microliter met een totaal volume van minder dan honderd microliters. De eiextracten ondersteunen de vorming van maximaal 8.000 tot 9.000.
Kernen per microliter: incubeer het mengsel gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur om de kernen te laten vormen. Kernen worden gevisualiseerd met behulp van kleuring. Na ongeveer 30 minuten zullen de nieuw gevormde kernen klein zijn en een ovale vorm hebben.
Het DNA is nog vrij gecondenseerd en de nucleus moet eruitzien als een solide lichtblauw vlak tijdens het spinnen van de hook wanneer dit in het UV-kanaal wordt geobserveerd terwijl het DNA condenseert. Bovendien zal de blauwe kleuring minder homogeen worden, waarbij uiteindelijk zwarte openingen verschijnen. De vorming van het kernmembraan kan worden gevisualiseerd door één microgram per mannelijk exemplaar van 3,3-diaminocyclohexancarboxamide of DHCC aan het fixatief toe te voegen.
DHCC is een fluorescerende lipofiele kleurstof die wordt gevisualiseerd in het fluoresceïnekanaal. In de vroege stadia van de kernassemblage zijn membraanvesikels gebonden aan het chromatineoppervlak en beginnen deze in clusters te fuseren. Dit resulteert in een ongelijkmatig en discontinu uiterlijk van de vormende membraan.
Zodra het membraan voltooid is, vlakt het uit over het nucleaire oppervlak en verschijnt het als een gelijkmatige, ononderbroken rand rond het DNA. Er zal een aanzienlijke hoeveelheid achtergrondfluorescentie in het omringende cytosol zijn door membraanvesikels die niet in de kernen zijn opgenomen. We hebben u zojuist in vitro nucleaire reconstitutie gedemonstreerd met behulp van oplosbare en lichte membraanfracties uit xenopus-eiextract.
Het is belangrijk om te onthouden dat ruw extract gebruikt kan worden voor nucleaire assemblage, maar niet na invriezen en ontdooien. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Overzicht
Dit artikel bespreekt de in vitro reconstitutie van nucleaire assemblage met behulp van eiextracten van Xenopus. Het proces omvat het combineren van sperma-chromatine met cytosolische componenten om functionele kernen te vormen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Nucleaire Assemblage
- In Vitro Technieken
Achtergrond
- De assemblage van de kernmembraan is cruciaal tijdens de celdeling.
- Eiextracten van Xenopus bieden een model voor het bestuderen van nucleaire processen.
- Gereconstitueerde kernen kunnen normale nucleaire functies uitvoeren.
- Begrip van de nucleaire assemblage kan bijdragen aan onderzoek in de celbiologie.
Doel van de studie
- Om de vorming van kernen in vitro aan te tonen.
- Om de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de assemblage van de kern te karakteriseren.
- Om onderzoekers van een gedetailleerd protocol te voorzien.
Gebruikte methoden
- Bereiding van gefractioneerd cytosol en toevoeging van fosfocreatine, creatinekinase en ATP.
- Incorporatie van lichte membranen en spermachromatine in het extract.
- Incubatie van het mengsel om de vorming van kernen mogelijk te maken.
- Visualisatie van kernen met behulp van fluorescente kleuringstechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van synthetische kernen uit spermachromatine en eiextracten.
- Visualisatie van de assemblage van de kernmembraan en de incorporatie van het poriecomplex.
- Karakterisering van het assemblageproces via immunodepletie en eiwitbewerking.
- Observatie van de dynamiek van membraanvesikelfusie tijdens de assemblage.
Conclusies
- De studie biedt een betrouwbare methode voor in vitro nucleaire assemblage.
- Er is inzicht verkregen in de mechanismen van de vorming van de kernmembraan.
- Dit protocol kan worden gebruikt voor verder onderzoek in de celbiologie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
In vitro nucleaire assemblage met gebruik van gefractioneerde Xenopus-eiextracten maakt mechanistische dissectie van de vorming van het kernmembraan mogelijk, een kritieke gebeurtenis bij celdeling en genoomcompartimentalisatie. Dit systeem biedt een controleerbaar platform voor het onderzoeken van de biogenese van de kernenvelop, wat bijdraagt aan het voorspellend vertrouwen in vroege ontdekkings- en targetvalidatieworkflows. De modulariteit en reproduceerbaarheid maken het waardevol voor portfolio-brede standaardisatie van assays voor nucleaire assemblage.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe toetsing van hypothesen over nucleaire assemblage mogelijk door de samenstelling van het extract te manipuleren.
- Ondersteunt functionele validatie van kandidaatproteïnen via immunodepletie of de toevoeging van proteïnen.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door variabelen in de vorming van de kernenvelope te isoleren.
- Biedt een kwantitatieve uitlezing voor de verduidelijking van signaalpaden en prioritering van targets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Stelt een reproduceerbaar in vitro-systeem vast voor het evalueren van modulatoren van nucleaire assemblage.
- Levert gestandaardiseerde, kwantificeerbare resultaten via fluorescentiegebaseerde nucleaire visualisatie.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van assays en cross-lab reproduceerbaarheid voor compound screening.
- Maakt betrouwbare benchmarking van nucleaire import- en membraanfusiegebeurtenissen mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde pathways waarbij de integriteit van de kernenvelope betrokken is.
- Biedt continuïteit van mechanistische ontdekking naar validatie in preklinische modellen.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van therapeutische strategieën gericht op de celkern.
- Biedt voorspellende risicoreductie voor defecten in de kernassemblage die betrokken zijn bij ziekten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit in vitro-assemblagesysteem slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurde tests van de vorming en functie van de kernenvelope mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de isolatie en manipulatie van variabelen voor de nucleaire assemblage voor route-analyse.
- Screening: Biedt een robuust platform voor de kwantitatieve beoordeling van kernvorming en membraanfusie.
- Analytica: Maakt fluorescentiegebaseerde meting van de kinetiek en volledigheid van de nucleaire assemblage mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de modellering van defecten in de kernenvelop die relevant zijn voor menselijke ziekten.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een gestandaardiseerde, herbruikbare assay voor nucleaire assemblage over meerdere R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in mechanismen van nucleaire assemblage en targetvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare workflows voor studies naar nucleaire assemblage.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door afhankelijkheden in nucleaire pathways te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van assets gericht op de nucleus mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de bereiding van extracten en fluorescentiemicroscopie.
- Toegang tot gefractioneerde Xenopus-ei-extracten en gespecialiseerde kleuringsreagentia is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpassing voor verschillende chromatine- of membraanbronnen kan noodzakelijk zijn.
- Afhankelijk van de kwaliteit van verse extracten; invriezen en ontdooien kunnen de resultaten beïnvloeden.
