Met behulp van Laser pincet voor het manipuleren van geïsoleerde neuronen in vitro

Ashkin was de eerste die aantoonde dat laserspinnen of optische vallen een krachtig instrument zijn voor het manipuleren van microscopische, gemineraliseerde levende objecten. In deze video laten we zien hoe we deze technologie hebben toegepast om neuronen te vangen en te verplaatsen. Dit is het werkstation voor optische pincetten.

De groene pijlen tonen het pad van de laserstraal door de optiek van de microscoop. Wanneer een laserstraal die door de objectieflens van de microscoop wordt gefocust, wordt gebroken door een cel, werkt de kracht die de richting van de lichtstraal verandert op de cel, waardoor de cel naar het brandpunt wordt bewogen.

Dit genereert piko-Newton aan kracht, wat voldoende is om een cel door het medium te trekken. In deze video bespreken we de fabricage van schaaltjes, de preparatie van retina-cellen, het uitplaten van cellen op gekweekte schaaltjes, manipulatie met optische pincetten en de observatie van celgroei. Omdat cellen aan glas hechten, moesten we een celafstotend gebied creëren waar cellen gemakkelijk met de pincetten gevangen kunnen worden.

De helft van de schaal werd gecoat met polyhema, een celafstotend polymeer. De andere helft werd gecoat met cellone, een substraat dat de groei van onze cellen ondersteunt. Eerst wordt een cel geïdentificeerd aan de celadhesieve zijde van de schaal.

Vervolgens wordt een andere cel op de polymeerzijde gevangen en getransporteerd naar de adhesiezijde, waar beide cellen worden gekoppeld. Voor de bereiding van de schaaltjes gebruiken we gesteriliseerde polystar kweekschaaltjes van 35 millimeter, die stofvrij zijn gemaakt met een luchtstroom. Eerst maken we met een kleine draaibank of een boormachine een gat van één centimeter in de bodem.

Neem zuurreine dekglasjes en plaats deze rechtop in een stofvrije omgeving, zoals een zuurkast. Neem de polyus-oplossing opgelost in 95%alcohol en breng enkele druppels aan nabij de bovenkant van het dekglas, op slechts één helft. Laat de poly-hema drogen. Markeer de zijde van het dekglas met polyus.

Plaats de S guard rond het gat in de bodem van de kweekschaal. Lijm het dekglas met de S guard aan de schaal. Zorg ervoor dat het polyamide aan de binnenzijde zit en controleer of er geen lekken zijn door kieren in de sill guard.

Plaats het dekglas zodanig dat de rand van de poly-hema coating over het midden van de schaal loopt. Laat de schaal twee tot drie dagen drogen en kras vervolgens met een diamantpen markeringen in de bodem van de schaal; deze dienen als referentiepunten voor het positioneren van de schaal op de microscooptafel. Plaats de schalen in de zuurkast en steriliseer ze onder het ultraviolette licht.

Plaats één of twee druppels geiten-anti-US-antilichaamoplossing op de niet-polyus-zijde van de schaal, waarbij u er zorg voor draagt dat dit niet op de poly-hemische coating morst, en laat dit ongeveer drie uur inwerken. Verwijder de oplossing en was met steriele Ringer-oplossing. Plaats de cel één-antilichaamoplossing op hetzelfde gebied en incubeer dit gedurende de nacht, zodat het de volgende dag gereed is voor het experiment.

De cellen in ons laboratorium zijn afgeleid van retina's van volwassen salamanders in de aquatische fase. De retina's worden gedissecteerd en verwijderd, en vervolgens met enzymen verteerd. De kweekschaal kan daarna worden gezaaid met de geïsoleerde cellen.

De ogen worden verwijderd. Het hoornvlies wordt gedisseceerd en verwijderd. De oogbeker wordt in steriele Ringer-oplossing geplaatst.

Het netvlies wordt gescheiden van de oogbeker door het eruit te scheppen met de rand van een gebogen pincet. Koolstofdioxide en zuurstof worden in een ringeroplossing met propaan gebubbelled en vervolgens gesteriliseerd via een ultrafijn filter van 0,2 micron. De netvliezen worden in de enzymoplossing geplaatst en gedurende ongeveer 40 minuten onder agitatie gedigesteerd om het weefsel af te breken.

Na drie keer wassen worden de retina's gedissocieerd met tri. Met behulp van een pipetteerball van drie millimeter zijn de geïsoleerde cellen klaar voor het uitplaten. De kweekschaal met medium wordt op de objecttafel van de microscoop geplaatst en correct georiënteerd met behulp van de krasmarkeringen op de bodem van de schaal.

Hierdoor kan de exacte positie van de schaal op een later tijdstip worden gereproduceerd. De cellen worden vervolgens geplaatst op zowel de poly-hema- als de cell-one-zijde van de schaal. De positie van de schaal op de microscooptafel, evenals het laservermogen, wordt met de joystick geregeld.

Eerst identificeerden we een cel die aan één zijde van de schaal gehecht was. Dit is een multipolaire retinale cel, herkenbaar aan de dendrieten. De coördinaten van de positie van de cel worden opgeslagen.

Dit is een staafvormige fotoreceptorcel aan de polyus celafstotende zijde van de schaal. De schaal wordt verlaagd, waarna de cel door de laser wordt vastgegrepen en van de bodem van de schaal wordt opgetild. De cel wordt nu naar de andere zijde van de schaal getransporteerd, naar de coördinaten van de multipolaire cel.

In werkelijkheid is de cel stationair. Het is de schaal die beweegt. De cel passeert nu de rand van de poly-hemo coating.

De uitstulping die vanuit de cel naar buiten steekt, is het axonterminal. De cel bevindt zich ruim boven het celpuin en andere cellen op de bodem van de schaal, die de beweging zouden kunnen belemmeren. De onscherpe beelden van cellen op de bodem van de schaal zijn zichtbaar op de achtergrond.

De staafcel bereikt de multipolaire cel en kan nauwkeurig worden gepositioneerd op het gewenste punt en op de gewenste afstand van die cel. De schaal wordt omhooggetild en de cel hecht zich aan het substraat van de eerste cel. De belangrijkste voordelen van deze procedure zijn dat men kan kiezen welke cellen worden verplaatst en dat de manipulaties kunnen plaatsvinden in een afgesloten steriele experimentele omgeving.

Cel-celinteracties kunnen worden gemonitord met video-time-lapse of via digitale fotografie. Optische pincetten kunnen worden gebruikt in combinatie met elke biologische techniek. Hier demonstreert bijvoorbeeld een fluorescentietechniek de aanwezigheid van synaptische eiwitten op de verbindingspunten tussen cellen die door de pincetten zijn bewogen.