Name: Met behulp van Laser pincet voor het manipuleren van geïsoleerde neuronen in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer hoe u laserpincetten gebruikt om geïsoleerde neuronen in vitro te manipuleren. Deze techniek maakt precieze positionering van cellen mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek naar neuronaal gedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek werd gesteund door NIH Grants EY012031 en EY0182175 en de FM Kirby Foundation.

Optische pincetten voor het manipuleren van geïsoleerde cellen in cultuur Trapping krachten van een optisch pincet, zijn van de dynamiek van licht (Ashkin, 1991;. Ashkin et al., 1986). Hoewel deze krachten makkelijk vangen cellen in suspensie, zijn ze niet in staat om cellen die hechten aan een oppervlak bewegen. Daarom, om de hechting aan de cultuur schotel op het punt waar de cellen zijn opgesloten te verminderen, is het dekglaasje bedekt met poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) (Sigma Chemical Co, St Louis, MO), een niet-toxisch verbinding met cell afstotend eigenschappen die eerder ingezet voor hechting studies op endotheelcellen (Folkman en Moscona, 1978). Terwijl de poly-HEMA beslaat de helft van de cultuur schotel, is de andere helft bedekt met een substraat dat de celgroei ondersteunt. In ons laboratorium, is Sal-1 gebruikt als substraat voor het kweken van salamander retinale cellen. De procedure voor het vervaardigen van Sal-1 en poly-HEMA gecoate gerechten wordt hieronder beschreven: Fabricage van de cultuur gerechten <ol><li> Schoon coverglasses (# 1 VWR Scientific Inc, Media, PA) in zuur. Dit dekglaasje werd geselecteerd voor zijn dikte van slechts 0,1 mm, noodzakelijk voor de hoge numerieke apertuur doelstellingen die nodig zijn voor het richten van de laser. </li><li> Voor het maken van een cel afstotend, op 20 mg poly-HEMA (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) &#39;s nachts op te lossen in 1 ml van 95% ethanol bij kamertemperatuur. Bij voorkeur moet deze oplossing worden gebruikt binnen een maand van voorbereiding. </li><li> Prop de coverglasses op een bijna verticale positie in een stofvrije omgeving, zoals een kap. </li><li> Plaats een of twee druppels van poly-HEMA oplossing buurt van de top van het dekglaasje van het plastic uiteinde van een 200μl micropipet. De druppels (ongeveer 50-100μl elk) moet worden beperkt tot de helft van de dekglaasje. De steile helling zorgt ervoor dat de vloeistof naar beneden stroomt het oppervlak van het dekglaasje naar de bodem, waardoor een dunne gelijkmatige laag van poly-HEMA. Laat de poly-HEMA gecoat coverglasses te drogen in de kap voor 30-60 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Markeer de poly-HEMA kant van het dekglaasje met een fijne tip pen dicht bij de rand. </li><li> Boor een 1 cm gat in de bodem van een 35 mm cultuur schotel. </li><li> Lijm de poly-HEMA gecoat dekglaasje aan de onderkant van de cultuur schotel met Sylgard 184 (Dow Corning Co, Midland, MI), zodat de poly-HEMA gecoate zijde gezicht naar de binnenkant van de schotel. Zorg ervoor dat de rand van de poly-HEMA coating loopt in het midden van het gat. Laat de vaat drogen voor 1-3 dagen bij kamertemperatuur in een stofvrije omgeving. </li><li> Kras een lijn op de buitenkant van het dekglaasje met een diamant-tip pen naar aanleiding van de rand van de poly-HEMA coating. Dan, scratch twee kruisende lijnen haaks op het ongeveer 2 mm van elkaar. De twee snijpunten dienen als referentie of referentiepunten om te worden gebruikt voor het reproduceren van dezelfde oriëntatie van de cultuur schotel op de microscoop podium. </li><li> Steriliseer de gerechten onder ultraviolet licht &#39;s nachts. </li><li> Om een ​​cel-aanhanger de helft van de cultuur schotel, vacht van de niet poly-HEMA half met Sal-1, die een muis anti-salamander antilichaam opgewekt tegen het netvlies celmembranen (genereus verzorgd door dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine bevat te creëren , Atlanta, GA, zie MacLeish et al. (1983)).. De eerste, jas de Sal-1 zijde met ongeveer 100μl van 0,1 mg / ml steriel geit anti-muis IgG antilichaam (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis IN), zorg ervoor dat u de vloeistof spill-over op de poly-HEMA kant. Laat drie uur, vervolgens verwijderen. Was het hetzelfde gebied met de oplossing steriele Ringer&#39;s een of twee keer, plaats dan 100μl Sal-1 supernatant, zorg ervoor dat u de vloeistof morst in de poly-HEMA kant van de schotel. Het eerste antilichaam zorgt voor Sal-1 is gecoat bij een bekende concentratie. </li><li> Incubeer de schotels met de Sal-1 &#39;s nachts. </li><li> Verwijder de Sal-1 antilichaam-oplossing en spoel het gebied met steriele Ringer&#39;s oplossing. Introduceer 2 ml medium om de schotel vlak voor cel plating. </li></ol> De samenstelling van de oplossing van de amfibie Ringer&#39;s, serum-vrij medium amfibie, en Ringer-oplossing voor enzymdigestie zijn te vinden in MacLeish en Townes-Anderson (1988) en Mandell et al.. (1993). Voorbereiding van de celculturen De cellen die worden gebruikt in deze video waren afkomstig van licht aangepast, voor volwassenen, in het water levende tijger-fase salamanders (Ambystoma tigrinum), het meten van 17-22 cm in de lengte (Charles Sullivan Inc, Nashville, TN), gehandhaafd op 5 ° C op een 12 h: 12 uur licht-donker cyclus. De protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Geneeskunde en Tandheelkunde in New Jersey in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health. De procedures voor het bereiden van het netvlies celculturen worden beschreven door Nachman-Clewner en Townes-Anderson (1996) en zijn als volgt: <ol><li> Onthoofden en merg van de dieren. Verwijder de ogen en ontleden de hoornvliezen en de iris. Het netvlies moet een beetje los te maken binnen de oogschelp. Door het plaatsen van een gebogen pincet onder het netvlies, schep het netvlies. Het is niet belangrijk als de lens is bevestigd aan het netvlies in dit stadium. </li><li> Digest het netvlies in 14 U / ml papaïne (Worthington, Freehold, NJ) in oplossing salamander Ringer&#39;s voor 40 minuten. </li><li> Voorafgaand aan gebruik moet de papaïne Ringer-oplossing borrelen met 95% O 2 / 5% CO 2-gas voor 30 minuten., Vervolgens gesteriliseerd door passage door een 0,22 micron filter (Millipore, Carrigtwohill, Ierland). </li><li> Spoel de retina met oplossing steriele salamander Ringer&#39;s drie keer. </li><li> Verwijder de lenzen uit de oplossing van de Ringer&#39;s, dan voorzichtig vermaal het retinaal weefsel met een 3 mm boring pipet aan op een celsuspensie opbrengst. </li></ol> Laser pincet manipulatie van geïsoleerde neuronen <ol><li> Plaats de cultuur schotel op de microscoop podium, oriënteren de schotel door het af een merkteken op de schotel met een referentiepunt op het podium. Sla de coördinaten van de vaste punten in de computer. </li><li> Plaat-cellen op beide Sal-1 en poly-HEMA helften van de schotel. </li><li> Laat de cellen om zich te vestigen voor ongeveer 20 minuten, dat is lang genoeg voor cellen aan de klevende zijde van de schotel te hechten aan het antilichaam substraat. </li><li> Selecteer een cel op het Sal-een klevende zijde van de schotel. Markeer de x-en y-coördinaten van het podium een ​​positie dicht bij de cel. In ons geval, het punt was ongeveer 10μm van de primaire dendrieten van de geselecteerde cel. Save coördinaten in de computer. </li><li> Selecteer een tweede neuron, in ons geval een fotoreceptor, op de poly-HEMA kant van de schotel en het gebruik van de laser pincet gereedschap om het te vangen. Trapping kan worden bereikt over een breed scala aan vermogen. Maar we stellen de kracht van de laser op 10% -20%, wat laag genoeg is om trapping vuil te voorkomen, samen met de cel, maar voldoende om de cel transport door het medium. </li><li> Terwijl u de cel in de val, hoe lager de fase, zodat de cel is ruim boven het oppervlak van de cultuur schotel en boven alle aangesloten neuronen. Verplaats de stage onder computer controle om de cel te brengen naar de eerder opgeslagen x-en y-coördinaten op de Sal-1 kant. Het podium beweging werd vastgesteld op 8-20μm / s, maar een maximale snelheid moet empirisch worden bepaald. Bij aankomst op de plaats van bestemming punt op de Sal-1 zijde, verhogen het podium om de gevangen cel te brengen aan het oppervlak van de schotel. Cel plaatsing kan worden gemaakt met een nauwkeurigheid van enkele microns. Laat de cel te houden aan de Sal-een substraat. </li><li> Het verkrijgen van gedigitaliseerde beelden van beide cellen in het paar voor en na paar vorming biedt een handig overzicht. </li><li> Handhaaf de cel paren in een couveuse. Voor de salamander cellen, plaats de gerechten in een vochtige kamer bij 10 ° C. Cellen kunnen worden gevolgd door video-time lapse en gebruikt worden met elke cel vereiste biologische techniek. </li></ol>

<ol><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+Single-Beam+Gradient+Force+Optical+Trap+for+Dielectric+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles.</a> Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).</li>
<li>Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+cells+have+different+target+preferences+in+vitro+as+revealed+by+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vision%22%5BJournal%5D)">Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers.</a> Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).</li>
<li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+shape+in+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li>
<li>Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+localized+cell+heating+induced+by+infrared+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).</li>
<li>MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+monoclonal+antibody+as+a+substrate+for+mature+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).</li>
<li>MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+synapse+formation+among+major+classes+of+adult+salamander+retinal+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro.</a> Neuron. 1, 751-760 (1988).</li>
<li>Mandell, J. W., MacLeish, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Townes-Anderson+E.+Process+outgrowth+and+synaptic+varicosity+formation+by+adult+photoreceptors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro.</a> J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).</li>
<li>Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-induced+remodelling+and+regeneration+of+the+ribbon+presynaptic+terminal+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro.</a> J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).</li>
<li>Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+retinal+neurons+by+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis.%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers.</a> Mol. Vis.. 4, (1998).</li>
</ol>

Licht heeft momentum, en wanneer een lichtstraal wordt gebroken als het door een cel, een kracht nodig om de richting van het momentum te veranderen. Omwille van de wet van behoud van impuls, moet er een kracht in tegengestelde richting op zijn beurt weer reageren op een cel. Ashkin (1991) toonde aan dat de kracht die door een laserstraal gericht door een microscoop objectief zal een cel te verplaatsen naar het midden van de focus. Hoewel een laserstraal genereert slechts een paar picoNewtons van kracht, deze kracht is voldoende om een ​​ce...

<table><tbody><tr><td>25mm cirkel nr.1 dekglas</td><td>VWR international</td><td>48380 080</td><td></td></tr><tr><td>poly-2-hydroxyethylmethacrylaat (poly-HEMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3932</td><td>Oplossen in 95% ethanol</td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG-antilichaam</td><td>Chemicon International</td><td>AP181</td><td> 1mg in 1ml, 10x verdunnen voor gebruik</td></tr><tr><td>Sal-1 supernatant bevattend muis anti-salamander antilichaam</td><td>vrijgevig verstrekt door Dr. Peter MacLeish</td><td></td><td>Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA</td></tr><tr><td>3 mm boring 5ml pyrex wegwerppipetten</td><td>Corning</td><td>7078A-5</td><td></td></tr><tr><td>Celkweekschalen 35mm x 10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 siliconen elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optische pincet-microtool of laserspanning</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 W continu-golf diodelaser met een golflengte van 980nm</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 omgekeerde lichtmicroscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x olie-immersie plan neofluor objectief</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Numerieke apertuur (N.A. 1.3)</td></tr><tr><td>Zwart-wit CCD-camera</td><td>Sony Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer en joystick met software</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td>voor het aansturen van een gemotoriseerde tafel</td></tr></tbody></table>

met behulp van laser pincet voor het manipuleren van geïsoleerde neuronen in vitro

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In dit artikel en video, beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in ons laboratorium aan de doelgerichtheid voorkeuren van regenereren van celprocessen van volwassen netvlies neuronen in vitro studie. Procedures voor het bereiden van het netvlies celculturen beginnen met de dissectie, de spijsvertering en fijnwrijven van het netvlies, en eindigen met de beplating van geïsoleerde cellen op het netvlies gerechten speciaal voor gebruik met laser-pincet. Deze gerechten zijn onderverdeeld in een cel lijm half en een cel afweermiddel half. De cel klevende kant is bedekt met een laag van Sal-1-antilichamen, die een substraat waarop onze cellen groeien. Andere lijm substraten gebruikt kunnen worden voor andere celtypes. De cel afweermiddel zijde is bedekt met een dunne laag van poly-HEMA. De cellen geplateerd op de poly-HEMA kant van de schaal worden gevangen met de laser pincet, vervoerd en vervolgens naast geplaatst om een ​​cel op het Sal-1 kant om een ​​paar te creëren. Vorming van celgroepen van elke omvang mogelijk moet zijn met deze techniek. &quot;Laser-pincetten gecontroleerde micromanipulatie&quot; betekent dat de onderzoeker kan kiezen welke cellen om te bewegen, en de gewenste afstand tussen de cellen kunnen worden gestandaardiseerd. Omdat de laserstraal gaat door transparante vlakken van de cultuur schotel, zijn cel selectie en plaatsing gebeurt in een gesloten, steriele omgeving. Cellen kunnen worden gecontroleerd door video time-lapse en gebruikt worden met elke cel vereiste biologische techniek. Deze techniek kan helpen onderzoeken van cel-cel interacties.

Deze video beschrijft de manipulatie van gekweekte neuronen met behulp van laser-pincet in vitro.

Met behulp van Laser pincet voor het manipuleren van geïsoleerde neuronen in vitro

In dit artikel en deze video beschrijven wij de protocollen die in ons laboratorium worden gebruikt om de targeting-voorkeuren van regenererende celuitlopers van volwassen ...

Ashkin was de eerste die aantoonde dat laserspinnen of optische vallen een krachtig instrument zijn voor het manipuleren van microscopische, gemineraliseerde levende objecten. In deze video laten we zien hoe we deze technologie hebben toegepast om neuronen te vangen en te verplaatsen. Dit is het werkstation voor optische pincetten.De groene pijlen tonen het pad van de laserstraal door de optiek van de microscoop. Wanneer een laserstraal die door de objectieflens van de microscoop wordt gefocust, wordt gebroken door een cel, werkt de kracht die de richting van de lichtstraal verandert op de cel, waardoor de cel naar het brandpunt wordt bewogen.Dit genereert piko-Newton aan kracht, wat voldoende is om een cel door het medium te trekken. In deze video bespreken we de fabricage van schaaltjes, de preparatie van retina-cellen, het uitplaten van cellen op gekweekte schaaltjes, manipulatie met optische pincetten en de observatie van celgroei. Omdat cellen aan glas hechten, moesten we een celafstotend gebied creëren waar cellen gemakkelijk met de pincetten gevangen kunnen worden.De helft van de schaal werd gecoat met polyhema, een celafstotend polymeer. De andere helft werd gecoat met cellone, een substraat dat de groei van onze cellen ondersteunt. Eerst wordt een cel geïdentificeerd aan de celadhesieve zijde van de schaal.Vervolgens wordt een andere cel op de polymeerzijde gevangen en getransporteerd naar de adhesiezijde, waar beide cellen worden gekoppeld. Voor de bereiding van de schaaltjes gebruiken we gesteriliseerde polystar kweekschaaltjes van 35 millimeter, die stofvrij zijn gemaakt met een luchtstroom. Eerst maken we met een kleine draaibank of een boormachine een gat van één centimeter in de bodem.Neem zuurreine dekglasjes en plaats deze rechtop in een stofvrije omgeving, zoals een zuurkast. Neem de polyus-oplossing opgelost in 95%alcohol en breng enkele druppels aan nabij de bovenkant van het dekglas, op slechts één helft. Laat de poly-hema drogen. Markeer de zijde van het dekglas met polyus.Plaats de S guard rond het gat in de bodem van de kweekschaal. Lijm het dekglas met de S guard aan de schaal. Zorg ervoor dat het polyamide aan de binnenzijde zit en controleer of er geen lekken zijn door kieren in de sill guard.Plaats het dekglas zodanig dat de rand van de poly-hema coating over het midden van de schaal loopt. Laat de schaal twee tot drie dagen drogen en kras vervolgens met een diamantpen markeringen in de bodem van de schaal; deze dienen als referentiepunten voor het positioneren van de schaal op de microscooptafel. Plaats de schalen in de zuurkast en steriliseer ze onder het ultraviolette licht.Plaats één of twee druppels geiten-anti-US-antilichaamoplossing op de niet-polyus-zijde van de schaal, waarbij u er zorg voor draagt dat dit niet op de poly-hemische coating morst, en laat dit ongeveer drie uur inwerken. Verwijder de oplossing en was met steriele Ringer-oplossing. Plaats de cel één-antilichaamoplossing op hetzelfde gebied en incubeer dit gedurende de nacht, zodat het de volgende dag gereed is voor het experiment.De cellen in ons laboratorium zijn afgeleid van retina's van volwassen salamanders in de aquatische fase. De retina's worden gedissecteerd en verwijderd, en vervolgens met enzymen verteerd. De kweekschaal kan daarna worden gezaaid met de geïsoleerde cellen.De ogen worden verwijderd. Het hoornvlies wordt gedisseceerd en verwijderd. De oogbeker wordt in steriele Ringer-oplossing geplaatst.Het netvlies wordt gescheiden van de oogbeker door het eruit te scheppen met de rand van een gebogen pincet. Koolstofdioxide en zuurstof worden in een ringeroplossing met propaan gebubbelled en vervolgens gesteriliseerd via een ultrafijn filter van 0,2 micron. De netvliezen worden in de enzymoplossing geplaatst en gedurende ongeveer 40 minuten onder agitatie gedigesteerd om het weefsel af te breken.Na drie keer wassen worden de retina's gedissocieerd met tri. Met behulp van een pipetteerball van drie millimeter zijn de geïsoleerde cellen klaar voor het uitplaten. De kweekschaal met medium wordt op de objecttafel van de microscoop geplaatst en correct georiënteerd met behulp van de krasmarkeringen op de bodem van de schaal.Hierdoor kan de exacte positie van de schaal op een later tijdstip worden gereproduceerd. De cellen worden vervolgens geplaatst op zowel de poly-hema- als de cell-one-zijde van de schaal. De positie van de schaal op de microscooptafel, evenals het laservermogen, wordt met de joystick geregeld.Eerst identificeerden we een cel die aan één zijde van de schaal gehecht was. Dit is een multipolaire retinale cel, herkenbaar aan de dendrieten. De coördinaten van de positie van de cel worden opgeslagen.Dit is een staafvormige fotoreceptorcel aan de polyus celafstotende zijde van de schaal. De schaal wordt verlaagd, waarna de cel door de laser wordt vastgegrepen en van de bodem van de schaal wordt opgetild. De cel wordt nu naar de andere zijde van de schaal getransporteerd, naar de coördinaten van de multipolaire cel.In werkelijkheid is de cel stationair. Het is de schaal die beweegt. De cel passeert nu de rand van de poly-hemo coating.De uitstulping die vanuit de cel naar buiten steekt, is het axonterminal. De cel bevindt zich ruim boven het celpuin en andere cellen op de bodem van de schaal, die de beweging zouden kunnen belemmeren. De onscherpe beelden van cellen op de bodem van de schaal zijn zichtbaar op de achtergrond.De staafcel bereikt de multipolaire cel en kan nauwkeurig worden gepositioneerd op het gewenste punt en op de gewenste afstand van die cel. De schaal wordt omhooggetild en de cel hecht zich aan het substraat van de eerste cel. De belangrijkste voordelen van deze procedure zijn dat men kan kiezen welke cellen worden verplaatst en dat de manipulaties kunnen plaatsvinden in een afgesloten steriele experimentele omgeving.Cel-celinteracties kunnen worden gemonitord met video-time-lapse of via digitale fotografie. Optische pincetten kunnen worden gebruikt in combinatie met elke biologische techniek. Hier demonstreert bijvoorbeeld een fluorescentietechniek de aanwezigheid van synaptische eiwitten op de verbindingspunten tussen cellen die door de pincetten zijn bewogen.

using-laser-tweezers-for-manipulating-isolated-neurons-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video-artikel stellen we een methode voor het isoleren van een of...

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

In vivo Laser axotomy in C. elegans

This video demonstrates a method to isolate fluorescently labeled neurons from a mouse brain.

Isolating Fluorescently Labeled Neurons from a Murine Brain

Source: Morsch, M.,  et. al., Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2017) In this video, we explore the technique of high-intensity UV laser ablation for precisely targeting and studying individual neurons in transgenic zebrafish. We demonstrate how to prepare, immobilize, and visualize neuronal responses, highlighting the cellular dynamics of injury and recovery.

Selective Single-Neuron Laser Ablation in a Zebrafish Larva Using a Confocal Microscope

De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em&gt; In vivo</em

Wij meten de spanning release in een axon die gedeeltelijk was gelaedeerde met een laser dissector door gelijktijdige krachtspectroscopie meting uitgevoerd op een optisch gevangen probe gehecht aan het membraan van de axon. De ontwikkelde experimentele protocol evalueert de axon hechting aan de cultuur substraat.

Meting van spanningspennen Tijdens Laser Induced Axon Letsel aan Axonale Hechting Evalueer aan de ondergrond bij piconewton en Milliseconde Resolutie

Menselijke neuroprogenitor cellen (NPC) werden uitgebreid onder uitdijende omstandigheden. NPCs werden gedifferentieerd in neuron-rijke culturen in aanwezigheid van een combinatie van neurotrofinen. Neuronale merkers werden gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring. Om een ​​zuivere populatie van neuronen te isoleren, werden NPCs gedifferentieerd PEN membraan glijbanen en lasermicrodissectie werd uitgevoerd.

Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur

We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.

Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

Twee-foton beeldvorming, gekoppeld aan laser nanodissection, zijn nuttige hulpmiddelen om degeneratieve en regeneratieve processen te bestuderen in het centrale zenuwstelsel met subcellulaire resolutie. Dit protocol laat zien hoe u een label, afbeelding en ontleden enkele klimmen vezels in de cerebellaire schors in vivo.

Laser nanosurgery van Cerebellar Axonen<em&gt; In Vivo</em

De isolatie van individuele dopamine neuronen of het ventrale tegmentale met directe of indirecte immunohistochemie wordt aangetoond met behulp van lasermicrodissectie. Parameters voor isolatie van weefsel uit een glasplaatje met een infrarood laser en van membraansystemen dia met de combinatie van infrarood en ultraviolet laser besproken.

Lasermicrodissectie - Een demonstratie van de Isolatie van individuele dopamineneuronen en de Gehele Ventral tegmentum

We beschrijven een techniek voor neuronen en hun processen label via anterograde of retrograde tracer injecties in de hersenen kernen met een in vitro bereiding. We pasten een bestaande methode i n vitro tracer elektroporatie door gebruik te maken van fluorescent gelabelde muis mutanten en eenvoudige optische apparatuur om de nauwkeurigheid etikettering te verhogen.

Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

Leer hoe u laserpincetten gebruikt om geïsoleerde neuronen in vitro te manipuleren. Deze techniek maakt precieze positionering van cellen mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek naar neuronaal gedrag.

Met behulp van Laser pincet voor het manipuleren van geïsoleerde neuronen in vitro

Meer video's verkennen