Name: Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Leer een luciferase-gebaseerde reportergen-assay voor membraanbiogenese-onderzoek na fagocytose. Deze methode analyseert genregulatie en lipidsynthese met behulp van HEK293-cellen en latexdeeltjes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cel Cultuur <ol><li> Stock culturen van humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen worden gekweekt in 10-cm cultuur gerechten in &#39;medium A&#39;, bestaande uit Medium Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s (DMEM) aangevuld met een cocktail van antibiotica (100 eenheden per ml penicilline en 100 ug per ml streptomycine sulfaat) en 10% foetaal bovine serum (FBS). </li><li> Voor het instellen van cellen voor een experiment, het medium afgezogen en de cellen worden gewassen twee keer met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)-oplossing. </li><li> Het PBS wordt dan verwijderd en vervangen door 0,6 ml van een oplossing die 0,25% trypsine. </li><li> De schotel wordt geïncubeerd bij 37 ˚ C voor ongeveer 2 minuten totdat de cellen beginnen te los te maken. </li><li> 5,5 ml van het medium A wordt toegevoegd aan het trypsine te neutraliseren en de cellen worden geteld met een hemocytometer. </li><li> Cellen zijn verdund tot 320.000 cellen per ml en afgeleverd op 0,1 ml per putje in een polylysine gecoate 96-well plaat cultuur. </li><li> Zet de schaal in een weefselkweek incubator bij 37 ˚ C met een atmosfeer die 8,8% CO2 en te groeien voor 24 uur. </li></ol> Transfecties <ol><li> Bij de voorbereiding van transfecties, moet worden beschouwd als hoeveel herhalingen moeten worden uitgevoerd per experimentele condities en welke bedragen van plasmide zullen worden getransfecteerd. We routinematig uitvoeren van alle voorwaarden in drievoud en transfecteren een totaal van 50 tot 100 ng van het plasmide DNA per goed. Plasmide mixen moet minstens een reporter construct uiten vuurvlieg luciferase en een controle plasmide dat Renilla luciferase van een constitutieve promotor. </li><li> Plasmide oplossingen zijn gepipetteerd in 1,5 ml microcentrifugebuizen en aangevuld met 10 ul per steekproef van serum-vrij en antibiotica-vrij DMEM. Als er bijvoorbeeld 20 putten zijn elk te worden getransfecteerd met 50 ug DNA, voeg 200 ul DMEM tot 1 ug DNA. </li><li> Om de DMEM / DNA-oplossing toe te voegen 3 pl &#39;Transit 293 reagens&#39; (Mirus) per ug DNA. Meng door pipetteren op en neer en laat de monsters staan ​​bij kamertemperatuur gedurende tenminste 10 minuten. </li><li> Tijdens deze periode, verwijdert u het afdrukmateriaal uit de 96-well plaat en cultuur te vervangen door 90 ul vers medium A. </li><li> Aan elk putje toe te voegen 10 pi van het DMEM / DNA / Transit 293 mengsel. </li><li> Zet de schaal in een weefselkweek incubator bij 37 ˚ C met een atmosfeer die 8,8% CO2 en te groeien voor 24 uur. </li></ol> Fagocytose <ol><li> Worden suspensies bereid met medium B (een 1:1 mengsel van DMEM en Ham&#39;s F12 medium plus antibiotica en 10% FBS) plus 0,75-um latex kralen op nul tot 1 mg per ml. </li><li> Verwijder de media uit de 96-well plaat en cultuur te vervangen door 0,1 ml van de kraal suspensies in medium B. </li><li> Spin de plaat gedurende 2 min bij 1000 x g. </li><li> De cellen worden vervolgens gekweekt bij 37 ˚ C gedurende 6 tot 16 uur. Afhankelijk van de omstandigheden en de promotor worden gebruikt om te rijden luciferase, verhoogde reporter-gen expressie kan worden gedetecteerd na 1 tot 3 uur. </li><li> In dezelfde gevallen kan het nodig zijn om de cellen te incuberen met kralen voor 30 tot 60 minuten, doe dan twee wasbeurten met PBS van feitelijke kralen te verwijderen, en voeg vers medium voor het incuberen van de cellen voor een periode van tijd. </li></ol> Dual-GloTM Luciferase Assay <ol><li> Let op: ons protocol voor het gebruik van deze kit verschilt in sommige opzichten van die aanbevolen door de fabrikant. Het is aangepast aan de hoeveelheid van de reagentia die nodig per monster te verminderen. </li><li> Bereid een oplossing van 1 M DTT, te splitsen in meerdere kleine porties en bewaar bij -20 ˚ C. </li><li> Bereid een lysis buffer die 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) glycerol en 0,5% (v / v) Triton X-100. Voorafgaand aan het gebruik, aliquot een bedrag dat nodig is voor het experiment en voeg 1 ui per ml van 1 M DTT plus proteaseremmer cocktail tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 tot 1x. Niet opnieuw het overgebleven DTT oplossing. </li><li> Wanneer u de Dual-GloTM kit voor de eerste keer, de voorbereiding van de (Firefly) Luciferase Reagent door de overdracht van de volledige inhoud van een fles van de Dual-GloTM Luciferase Buffer (geleverd bij de kit) om een ​​fles Dual-GloTM Luciferase Substrate (op voorwaarde dat met de kit). Verdeel de ongebruikte Luciferase Reagent in 10 ml porties en bewaar bij -20 ˚ C. </li><li> Verwijder de 96-well plaat uit de weefselkweek incubator en plaats het op ijs. Verwijder de media door aspiratie, voeg 40 ul per putje van lysis buffer, en laat de plaat op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> In een witte, ondoorzichtige 96-well plaat (OptiplateTM-96, Perkin Elmer catalogus nummer 6005290) aliquot 15 ul per putje van Luciferase reagens, en voeg 15 ul van cellysaat. </li><li> Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 10 min en lees dan de luminescentie in een microplaat reader. </li><li> Vlak voor het gebruik, bereiden een passend bedrag van Renilla luciferase substraat-oplossing door het toevoegen van een deel Dual-GloTM Stop &amp; Glo ®; Reagens (geleverd bij de kit) om 100 delen Dual-GloTM Stop &amp; Glo ® Buffer (geleverd bij de kit). </li><li> Aan elk putje toe te voegen 15 ul per putje van de Renilla luciferase substraat-oplossing, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en daarna weer te meten van de luminescentie. </li></ol>

De auteurs hebben niets te verklaren.

studeren membraan biogenese met een luciferase-based reporter gene test

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

De studie van de coördinatie van de verschillende lipiden synthese wegen tijdens membraan biogenese is het nuttig om te werken met een experimenteel systeem waarbij membraan biogenese treedt snel op en in een induceerbare manier. We hebben ontdekt dat fagocytose van latex bolletjes is praktisch voor deze doeleinden als cellen snel synthetiseren membraanlipiden tot membraan zwembaden verloren als verpakkingsmateriaal tijdens deeltje verzwelging te vullen. Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-Glo Luciferase Assay System van Promega.

Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-GloTM Luciferase Assay System van Promega.

Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

Om de coördinatie van verschillende lipidenynthesespaden tijdens de membraanbiogenese te bestuderen, is het nuttig om te werken met een experimenteel systeem waarin het membraan ...

Hallo, ik ben IL OV en ik bestudeer de coördinatie van verschillende lipiden-synthesepaden voor membraanbiogenese. Het is nuttig om over een experimenteel systeem te beschikken waarin membraanbiogenese snel en induceerbaar plaatsvindt. We hebben ontdekt dat fagocytose van latexbolletjes bijzonder nuttig is voor dergelijke studies, omdat cellen zeer snel nieuwe membranen synthetiseren om die aan te vullen die in een vroeg stadium van het insluitingsproces als omhulsel verloren zijn gegaan.In deze video zal mijn collega Ong Zang de procedures demonstreren die zijn gebruikt om door fagocytose geïnduceerde veranderingen in genexpressie te bestuderen met behulp van een luciferase-gebaseerde reporter-assay benadering waarbij, hoi, ik ben X van het leverage of exon North in het Department of Molecular and the cellular biology aan de Harvard University. Vandaag zal ik u laten zien hoe u een reportergen-assay gebruikt om de regulatie van genen die betrokken zijn bij membraanbiogenese na fagocytose te analyseren. Laten we beginnen.Voor deze procedure gebruiken we culturen van humane embryonale nier 293-cellen. Deze cellen worden gekweekt in een kweekschaal van 10 centimeter in medium A, dat

studying-membrane-biogenesis-with-luciferase-based-reporter-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Met de groeiende belangstelling voor stamceltherapieën, moleculaire imaging technieken zijn ideaal voor de bewaking stamceltransplantatie gedrag na transplantatie. Luciferase reporter genen hebben ingeschakeld non-invasieve, repetitieve evaluatie van de overleving van de cel, de locatie en de proliferatie in vivo. Deze video zal laten zien hoe je hESC proliferatie track in een levende muis.

In vitro en in vivo bioluminescente reportergen-beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

The video demonstrates the luciferase assay used to quantify luciferase-tagged proteins. The assay uses an engineered luciferase enzyme composed of a large fragment that binds with the small fragment, which is conjugated with a protein of interest. The bound subunits form an active enzyme that, in the presence of the substrate, releases a luminescent signal. This signal is then quantified using a luminometer.

The Luciferase Assay: A High-Throughput Assay to Measure Luminescent Signals Using Engineered Nanoluciferase System-Based Bioreporters

This video demonstrates the split luciferase complementation assay to detect protein-protein interactions. In this assay, the proteins of interest are tagged to small and large fragments of the luciferase enzyme. When the proteins interact, the large and small fragments combine to form an active enzyme complex, which in the presence of a specific substrate, releases bright luminescence that can be measured.

Split Luciferase Complementation Assay to Identify Specific Protein-Protein Interactions

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Een in vitro bioluminescentie test om te bepalen van cellulaire circadiane ritme in de borstklier epitheliale cellen wordt gepresenteerd. Deze methode maakt gebruik van zoogdiercellen verslaggever plasmiden gedestabiliseerd luciferase onder de controle van de periode 2 gen promotor uitdrukken. Het kan worden aangepast aan andere celtypes te evalueren orgel-specifieke effecten op de circadiane ritme.

In Vitro Bioluminescentie Assay te karakteriseren Circadian Rhythm in borstklier epitheliale cellen

Genetisch gecodeerde luciferase is een populaire niet-invasieve verslaggever van genexpressie. Gebruik van een geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (ALLIGATOR) staat longitudinale opname van bioluminescente cellen onder een brede waaier van voorwaarden stelt. Hier laten we zien hoe ALLIGATOR kan worden gebruikt in het kader van circadiane ritmen onderzoek.

Flexibele meting van bioluminescente verslaggevers met behulp van een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas - en temperatuur-geoptimaliseerde Recorder (ALLIGATOR)

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Circadiane ritmes, die in de meeste organismen voorkomen, reguleren de tijdelijke organisatie van biologische processen. 3D-organoïden zijn onlangs naar voren gekomen als een fysiologisch relevant in vitromodel . Dit protocol beschrijft het gebruik van bioluminescente reporters om circadiane ritmes in organoïden te observeren, waardoor in vitro onderzoek naar circadiane ritmes in meercellige systemen mogelijk wordt.

Circadiane oscillaties monitoren met een bioluminescentiereporter in organoïden

Leer een luciferase-gebaseerde reportergen-assay voor membraanbiogenese-onderzoek na fagocytose. Deze methode analyseert genregulatie en lipidsynthese met behulp van HEK293-cellen en latexdeeltjes.

Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

Meer video's verkennen