Name: Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Leer een luciferase-gebaseerde reportergen-assay voor membraanbiogenese-onderzoek na fagocytose. Deze methode analyseert genregulatie en lipidsynthese met behulp van HEK293-cellen en latexdeeltjes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cel Cultuur <ol><li> Stock culturen van humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen worden gekweekt in 10-cm cultuur gerechten in &#39;medium A&#39;, bestaande uit Medium Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s (DMEM) aangevuld met een cocktail van antibiotica (100 eenheden per ml penicilline en 100 ug per ml streptomycine sulfaat) en 10% foetaal bovine serum (FBS). </li><li> Voor het instellen van cellen voor een experiment, het medium afgezogen en de cellen worden gewassen twee keer met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)-oplossing. </li><li> Het PBS wordt dan verwijderd en vervangen door 0,6 ml van een oplossing die 0,25% trypsine. </li><li> De schotel wordt geïncubeerd bij 37 ˚ C voor ongeveer 2 minuten totdat de cellen beginnen te los te maken. </li><li> 5,5 ml van het medium A wordt toegevoegd aan het trypsine te neutraliseren en de cellen worden geteld met een hemocytometer. </li><li> Cellen zijn verdund tot 320.000 cellen per ml en afgeleverd op 0,1 ml per putje in een polylysine gecoate 96-well plaat cultuur. </li><li> Zet de schaal in een weefselkweek incubator bij 37 ˚ C met een atmosfeer die 8,8% CO2 en te groeien voor 24 uur. </li></ol> Transfecties <ol><li> Bij de voorbereiding van transfecties, moet worden beschouwd als hoeveel herhalingen moeten worden uitgevoerd per experimentele condities en welke bedragen van plasmide zullen worden getransfecteerd. We routinematig uitvoeren van alle voorwaarden in drievoud en transfecteren een totaal van 50 tot 100 ng van het plasmide DNA per goed. Plasmide mixen moet minstens een reporter construct uiten vuurvlieg luciferase en een controle plasmide dat Renilla luciferase van een constitutieve promotor. </li><li> Plasmide oplossingen zijn gepipetteerd in 1,5 ml microcentrifugebuizen en aangevuld met 10 ul per steekproef van serum-vrij en antibiotica-vrij DMEM. Als er bijvoorbeeld 20 putten zijn elk te worden getransfecteerd met 50 ug DNA, voeg 200 ul DMEM tot 1 ug DNA. </li><li> Om de DMEM / DNA-oplossing toe te voegen 3 pl &#39;Transit 293 reagens&#39; (Mirus) per ug DNA. Meng door pipetteren op en neer en laat de monsters staan ​​bij kamertemperatuur gedurende tenminste 10 minuten. </li><li> Tijdens deze periode, verwijdert u het afdrukmateriaal uit de 96-well plaat en cultuur te vervangen door 90 ul vers medium A. </li><li> Aan elk putje toe te voegen 10 pi van het DMEM / DNA / Transit 293 mengsel. </li><li> Zet de schaal in een weefselkweek incubator bij 37 ˚ C met een atmosfeer die 8,8% CO2 en te groeien voor 24 uur. </li></ol> Fagocytose <ol><li> Worden suspensies bereid met medium B (een 1:1 mengsel van DMEM en Ham&#39;s F12 medium plus antibiotica en 10% FBS) plus 0,75-um latex kralen op nul tot 1 mg per ml. </li><li> Verwijder de media uit de 96-well plaat en cultuur te vervangen door 0,1 ml van de kraal suspensies in medium B. </li><li> Spin de plaat gedurende 2 min bij 1000 x g. </li><li> De cellen worden vervolgens gekweekt bij 37 ˚ C gedurende 6 tot 16 uur. Afhankelijk van de omstandigheden en de promotor worden gebruikt om te rijden luciferase, verhoogde reporter-gen expressie kan worden gedetecteerd na 1 tot 3 uur. </li><li> In dezelfde gevallen kan het nodig zijn om de cellen te incuberen met kralen voor 30 tot 60 minuten, doe dan twee wasbeurten met PBS van feitelijke kralen te verwijderen, en voeg vers medium voor het incuberen van de cellen voor een periode van tijd. </li></ol> Dual-GloTM Luciferase Assay <ol><li> Let op: ons protocol voor het gebruik van deze kit verschilt in sommige opzichten van die aanbevolen door de fabrikant. Het is aangepast aan de hoeveelheid van de reagentia die nodig per monster te verminderen. </li><li> Bereid een oplossing van 1 M DTT, te splitsen in meerdere kleine porties en bewaar bij -20 ˚ C. </li><li> Bereid een lysis buffer die 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10% (v / v) glycerol en 0,5% (v / v) Triton X-100. Voorafgaand aan het gebruik, aliquot een bedrag dat nodig is voor het experiment en voeg 1 ui per ml van 1 M DTT plus proteaseremmer cocktail tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 tot 1x. Niet opnieuw het overgebleven DTT oplossing. </li><li> Wanneer u de Dual-GloTM kit voor de eerste keer, de voorbereiding van de (Firefly) Luciferase Reagent door de overdracht van de volledige inhoud van een fles van de Dual-GloTM Luciferase Buffer (geleverd bij de kit) om een ​​fles Dual-GloTM Luciferase Substrate (op voorwaarde dat met de kit). Verdeel de ongebruikte Luciferase Reagent in 10 ml porties en bewaar bij -20 ˚ C. </li><li> Verwijder de 96-well plaat uit de weefselkweek incubator en plaats het op ijs. Verwijder de media door aspiratie, voeg 40 ul per putje van lysis buffer, en laat de plaat op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> In een witte, ondoorzichtige 96-well plaat (OptiplateTM-96, Perkin Elmer catalogus nummer 6005290) aliquot 15 ul per putje van Luciferase reagens, en voeg 15 ul van cellysaat. </li><li> Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 10 min en lees dan de luminescentie in een microplaat reader. </li><li> Vlak voor het gebruik, bereiden een passend bedrag van Renilla luciferase substraat-oplossing door het toevoegen van een deel Dual-GloTM Stop &amp; Glo ®; Reagens (geleverd bij de kit) om 100 delen Dual-GloTM Stop &amp; Glo ® Buffer (geleverd bij de kit). </li><li> Aan elk putje toe te voegen 15 ul per putje van de Renilla luciferase substraat-oplossing, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en daarna weer te meten van de luminescentie. </li></ol>

De auteurs hebben niets te verklaren.

studeren membraan biogenese met een luciferase-based reporter gene test

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

De studie van de coördinatie van de verschillende lipiden synthese wegen tijdens membraan biogenese is het nuttig om te werken met een experimenteel systeem waarbij membraan biogenese treedt snel op en in een induceerbare manier. We hebben ontdekt dat fagocytose van latex bolletjes is praktisch voor deze doeleinden als cellen snel synthetiseren membraanlipiden tot membraan zwembaden verloren als verpakkingsmateriaal tijdens deeltje verzwelging te vullen. Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-Glo Luciferase Assay System van Promega.

Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-GloTM Luciferase Assay System van Promega.

Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

Om de coördinatie van verschillende lipidenynthesespaden tijdens de membraanbiogenese te bestuderen, is het nuttig om te werken met een experimenteel systeem waarin het membraan ...

Hallo, ik ben IL OV en ik bestudeer de coördinatie van verschillende lipiden-synthesepaden voor membraanbiogenese. Het is nuttig om over een experimenteel systeem te beschikken waarin membraanbiogenese snel en induceerbaar plaatsvindt. We hebben ontdekt dat fagocytose van latexbolletjes bijzonder nuttig is voor dergelijke studies, omdat cellen zeer snel nieuwe membranen synthetiseren om die aan te vullen die in een vroeg stadium van het insluitingsproces als omhulsel verloren zijn gegaan.In deze video zal mijn collega Ong Zang de procedures demonstreren die zijn gebruikt om door fagocytose geïnduceerde veranderingen in genexpressie te bestuderen met behulp van een luciferase-gebaseerde reporter-assay benadering waarbij, hoi, ik ben X van het leverage of exon North in het Department of Molecular and the cellular biology aan de Harvard University. Vandaag zal ik u laten zien hoe u een reportergen-assay gebruikt om de regulatie van genen die betrokken zijn bij membraanbiogenese na fagocytose te analyseren. Laten we beginnen.Voor deze procedure gebruiken we culturen van humane embryonale nier 293-cellen. Deze cellen worden gekweekt in een kweekschaal van 10 centimeter in medium A, dat bestaat uit Basal Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FBS) en een cocktail van antibiotica. Met behulp van een standaardisatietechniek worden de cellen losgemaakt van de bodem van de schaal, geteld en vervolgens uitgeplaat op met polylysine gecoate 96-wells platen, waar ze 24 uur lang worden gekweekt tot aan het begin van de transfecties.Voor onze transfectie voeren we alle condities routinematig in triplikaat uit en transfecteren we in totaal 50 tot 100 nanogram plasmid DNA per well. Plasmidamengsels moeten ten minste het reporterconstruct dat vuurvlieg-luciferase tot expressie brengt en het controleplasmid dat Renilla-luciferase vanuit een constitutieve promotor tot expressie brengt, bevatten. Begin met het bereiden van een mengsel van serumvrij en antibioticavrij DMEM met TransIT-XF 2-93 transfectiereagens; gebruik 10 µL DMEM voor elke te transfecteren well en voeg 3 µL TransIT-XF 2-93 reagens toe per microgram plasmid DNA.Bijvoorbeeld, indien 20 wells elk getransfecteerd moeten worden met 50 nanogram DNA met drie microliter trans 2 9 3 reagens in 200 microliter DMEM. De oplossing wordt gemengd door herhaaldelijk op en neer te pipetteren en vervolgens gedurende ten minste vijf minuten ongestoord bij kamertemperatuur te laten staan. Vervolgens wordt het DNA gepipetteerd in afzonderlijke microcentrifugebuisjes. De concentraties van onze plus meter voorraadoplossingen liggen gewoonlijk tussen 10 en 100 nanogram per microliter.Zodra het DM M-transitmengsel vijf minuten heeft geïncubeerd, wordt het overgebracht naar de DNA-buis en wordt de oplossing opnieuw gemengd door te pipetteren. Laat de monsters vervolgens 20 minuten staan bij kamertemperatuur. Verwijder tijdens deze incubatie van 20 minuten het medium uit de 96-well cultuurplaat en vervang dit door 19 µL vers medium A; zodra de incubatie is voltooid, wordt 10 µL van het D-M-M-D-N-A-translatiemengsel aan elke well toegevoegd.Het mengsel moet direct in de bestaande vloeistof worden gepipetteerd. Zorg ervoor dat de pipetpunt de wand van de buis niet raakt. Het is tevens belangrijk om drie wells met cellen op te nemen die onbehandeld blijven voor inspectie.De gemiddelde luciferase-activiteit in deze wells zal later als achtergrond worden afgetrokken. Plaats de 96-wells plaat in de incubator op 37 °C en kweek de cellen gedurende 24 uur. Zodra de incubatie van 24 uur is voltooid, gaan we over tot het induceren van membraanbiosynthese, biosynthese van lax-beads. Bereid hiervoor eerst een suspensie voor bestaande uit celkweekmedium en lax-beads.Bereid hiervoor medium B, wat een een-op-een mengsel is van DMEM en Hanks F-12 medium, aangevuld met antibiotica en 10% FBS. Voeg vervolgens de 0,75 micron latex beads toe in concentraties tot 1 mg/mL. Uiteraard moet elk experiment controles bevatten waarbij geen beads worden toegevoegd.Verwijder vervolgens het medium uit de 96-wells cultuurplaat en voeg aan elke well 100 µL van de kraal-suspensie toe. Nadat de suspensie is toegevoegd, wordt de plaat twee minuten gecentrifugeerd bij 1000 G. Dit helpt om de kralen op de bodem van de well te concentreren en vergemakkelijkt fagocytose. Incubeer de cellen vervolgens bij 37 °C gedurende zes tot 16 uur.Afhankelijk van de condities en de promoter die wordt gebruikt om de luciferase-toename aan te sturen, kan de genexpressie van de promoter na één tot drie uur worden gedetecteerd. Voor bepaalde experimenten kan het noodzakelijk zijn om fal los te koppelen van de lipidsynthese, bijvoorbeeld om de effecten van bepaalde geneesmiddelen op de lipidsynthese te bestuderen zonder de partikelvorming te beïnvloeden. Incubeer de cellen in dergelijke gevallen met de beads gedurende 30 tot 60 minuten om de cellen de tijd te geven de beads op te nemen.Na deze incubatie worden de cellen twee keer gewassen met de PBS om niet-gebonden beads te verwijderen. Vervolgens wordt vers medium toegevoegd en worden de cellen zes tot 16 uur geïncubeerd voor expressie van het reportergen. Nu kunnen we doorgaan met de ferous-assays.Bereid ter voorbereiding op de Lucifer-assays een xis-buffer voor die 20 millimolaire Tris, HCl pH 7,8, 10% (volume/volume) glycerol en 0,5% (volume/volume) Triton X-100 bevat; bereid vooraf een adequate hoeveelheid voor die nodig is voor het experiment. Voeg vervolgens één microliter per milliliter van 1 molar DTT toe. Hergebruik de resterende DTT-oplossing niet.Voeg vervolgens een protease-remmercocktail toe tot een eindconcentratie van 0,5 tot 1×. Bij het voor het eerst gebruiken van de Dual-Glo kit, bereid het vuurvlieg-luciferase-reagens door de volledige inhoud van één fles Dual-Glo luciferase-buffer over te brengen naar één fles Dual-Glo luciferase-substraat. Verdeel het ongebruikte luciferase-reagens over 10 mm buisjes en bewaar deze bij -20 °C. Zodra het luciferase-reagens gereed is, haal de 96-wells plaat uit de weefselkweekincubator en plaats deze op ijs. Verwijder vervolgens het medium door aspiratie, voeg daarna 40 µL lysisbuffer per well toe en laat de plaat 30 minuten op ijs staan.Voeg vervolgens 15 µL Lucifer-reagens per putje toe. In een witte, ondoorzichtige 96-wells plaat gebruiken wij de Perkin S optive plate 96. Voeg daarna 15 µL cellysaat toe en incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Lees na 10 minuten de luminescentie af in een microplatereader. Voer vervolgens de vanilla luciferase-assay uit om gegevens voor het controleplasmide te verkrijgen. Bereid hiervoor vlak voor gebruik de juiste hoeveelheid luciferase-substraatoplossing door één deel dual-glow stop- en glow-reagens toe te voegen aan 100 delen.Dual-glow, stop- en glow-buffer. Voeg vervolgens 15 µL substraatoplossing toe aan elke well. Incubeer de plaat 10 minuten bij kamertemperatuur en meet daarna opnieuw de luminescentie.Let op: wij hebben het door de fabrikant aanbevolen protocol voor deze dual glow ferous assays aangepast. Om de hoeveelheid reagentia die nodig is voor het pro-monster te verminderen, kan de plaat nu opnieuw worden geanalyseerd met een plaatlezer. Zodra de gegevens met de microplaatlezer zijn verzameld, kunnen deze worden overgezet naar een spreadsheetprogramma zoals Microsoft Excel voor verdere analyse.Bereken eerst het gemiddelde van de drie niet-gereseceerde wells en trek deze waarde af van elk van de datapunten. Deel vervolgens voor elke getransfecteerde well de waarde voor firefly luciferase door de waarde voor luciferase en bereken daarna voor elke set van triplaat monsters het gemiddelde, de standaarddeviatie en de variatiecoëfficiënt.In ons voorbeeld gebruiken we de verschillende concentraties kralen, die op de x-as zijn uitgezet tegen de ratio van firefly- ten opzichte van vanilla-luciferaseactiviteit. Zoals u kunt zien, is er een dosisafhankelijke toename van deze ratio. We hebben zojuist aangetoond hoe een luciferase-gebaseerde reportergen-assay kan worden gebruikt om de expressie van de LDL-receptorpromotor te meten als reactie op fagocytose van latexkralen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er rekening mee te houden dat de cellen op het moment van transfectie slechts 80 tot 90% confluent zijn. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

studying-membrane-biogenesis-with-luciferase-based-reporter-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Met de groeiende belangstelling voor stamceltherapieën, moleculaire imaging technieken zijn ideaal voor de bewaking stamceltransplantatie gedrag na transplantatie. Luciferase reporter genen hebben ingeschakeld non-invasieve, repetitieve evaluatie van de overleving van de cel, de locatie en de proliferatie in vivo. Deze video zal laten zien hoe je hESC proliferatie track in een levende muis.

In vitro en in vivo bioluminescente reportergen-beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

The video demonstrates the luciferase assay used to quantify luciferase-tagged proteins. The assay uses an engineered luciferase enzyme composed of a large fragment that binds with the small fragment, which is conjugated with a protein of interest. The bound subunits form an active enzyme that, in the presence of the substrate, releases a luminescent signal. This signal is then quantified using a luminometer.

The Luciferase Assay: A High-Throughput Assay to Measure Luminescent Signals Using Engineered Nanoluciferase System-Based Bioreporters

This video demonstrates the split luciferase complementation assay to detect protein-protein interactions. In this assay, the proteins of interest are tagged to small and large fragments of the luciferase enzyme. When the proteins interact, the large and small fragments combine to form an active enzyme complex, which in the presence of a specific substrate, releases bright luminescence that can be measured.

Split Luciferase Complementation Assay to Identify Specific Protein-Protein Interactions

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Een in vitro bioluminescentie test om te bepalen van cellulaire circadiane ritme in de borstklier epitheliale cellen wordt gepresenteerd. Deze methode maakt gebruik van zoogdiercellen verslaggever plasmiden gedestabiliseerd luciferase onder de controle van de periode 2 gen promotor uitdrukken. Het kan worden aangepast aan andere celtypes te evalueren orgel-specifieke effecten op de circadiane ritme.

In Vitro Bioluminescentie Assay te karakteriseren Circadian Rhythm in borstklier epitheliale cellen

Genetisch gecodeerde luciferase is een populaire niet-invasieve verslaggever van genexpressie. Gebruik van een geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (ALLIGATOR) staat longitudinale opname van bioluminescente cellen onder een brede waaier van voorwaarden stelt. Hier laten we zien hoe ALLIGATOR kan worden gebruikt in het kader van circadiane ritmen onderzoek.

Flexibele meting van bioluminescente verslaggevers met behulp van een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas - en temperatuur-geoptimaliseerde Recorder (ALLIGATOR)

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Circadiane ritmes, die in de meeste organismen voorkomen, reguleren de tijdelijke organisatie van biologische processen. 3D-organoïden zijn onlangs naar voren gekomen als een fysiologisch relevant in vitromodel . Dit protocol beschrijft het gebruik van bioluminescente reporters om circadiane ritmes in organoïden te observeren, waardoor in vitro onderzoek naar circadiane ritmes in meercellige systemen mogelijk wordt.

Circadiane oscillaties monitoren met een bioluminescentiereporter in organoïden

Leer een luciferase-gebaseerde reportergen-assay voor membraanbiogenese-onderzoek na fagocytose. Deze methode analyseert genregulatie en lipidsynthese met behulp van HEK293-cellen en latexdeeltjes.

Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

Meer video's verkennen