Het maken van Patch-pipetten en Sharp elektroden met een programmeerbare Puller

Glas capillaire pipettes zijn overal in laboratoria te vinden voor een breed scala aan technieken, zoals elektroporatie van enkele cellen, DNA micro-injectie en patch clamp elektrofysiologie. Om glas capillaire patch clamp elektroden voor opnames voor te bereiden, wordt silicaatglas getrokken op een programmeerbare pool. De elektrodenpunten worden bedekt met was en vervolgens worden de uiteinden met vuur gepolijst en opgeslagen voor toekomstig gebruik. Hallo, ik ben Miriam Goodman van het Departement Moleculaire en Cellulaire Fysiologie aan Stanford University.

In deze video laat ik zien hoe je patch clamp pipetten en scherpe elektroden voor elektrofysiologie maakt. Glas micro-elektroden, ook wel pipetten genoemd, zijn al decennia lang een werkpaard in de elektrofysiologie. Tegenwoordig worden deze pipetten gemaakt van glas capillairen met behulp van een programmeerbare pull.

Dus laten we beginnen. Om patch clamp pipetten te maken, gebruiken we Sutter boer zijde bij capillairen die schoon en stofvrij zijn, en we gebruiken de Sutter P negen zeven vlammende grond micro-elektrode puller. Sutter's Pipette Kookboek is een uitstekende referentie voor het ontwikkelen van geschikte pull-programma's.

Om te beginnen, til je de stofkap op de puller op. Neem dan een glas capillaire buis uit de doos. Zorg ervoor dat je de deksel weer op zijn plaats legt om stofophoping te minimaliseren.

Vervolgens, met één hand, schuif je de capillaire buis in de groef aan één kant van het filament, draai de klem iets vast. Op dit punt moet de klem strak genoeg zijn om te voorkomen dat de buis valt, maar los genoeg zodat je hem in de groef kunt schuiven. Laat nu de veermetaalstop op dezelfde kant los.

Vervolgens grijpt u met uw duim en wijsvinger de metalen tabbladen die aan de onderkant van beide dragers zijn bevestigd. Laat de andere veermetaalstop los. Trek de dragers zo ver mogelijk naar elkaar toe en houd ze met één hand op hun plaats.

Vervolgens schuif je de buis door de filamentbehuizing in de groef van de drager aan de andere kant. Zorg ervoor dat je het glas niet in het verwarmingsfilament duwt. Draai de klemmen aan beide kanten vast.

Ze moeten strak genoeg zijn om de dragers op hun plaats te houden, maar niet zo strak dat het glas wordt verpletterd. Sluit nu de stofkap en druk op de groene knop. Gemarkeerde pool pipetten voor patch clamp opnames worden gevormd met behulp van een vijfstappen polling-programma met afnemende warmte en snelheid bij elke stap en een kleine pool bij de laatste stap.

Dit programma gebruikt warmte en zwaartekracht. De procedure voor het maken van scherpe elektroden is zeer vergelijkbaar, maar in dit geval gebruiken we het dunne glas capillair van Warner Instruments met een buitendiameter van één millimeter en een binnendiameter van 0,78 millimeter. We passen ook een pull-programma toe dat een motor gebruikt naast warmte en zwaartekracht wanneer de pull-programma's zijn voltooid.

Til de stofkap op, maak beide klemmen los en verwijder de voltooide pipet. Doe de pipetten vervolgens in een werkdoos. De doos kan worden gemaakt door een strook schuim op de houder van een plastic pipettentipdoos te lijmen en vervolgens zes tot acht spleten in het schuim te snijden.

Plaats de pipetten in de spleten. Zodra de doos vol is met getrokken pipetten, ga je verder met de stap van vuur polijsten om de pipetten met vuur te polijsten. Zet een micro-smederij op met een platina verwarmingsfilament dat wordt bediend door een voetpedaal voordat je begint met het vuur polijsten.

Bedek de pipet eerst met tandheelkundig was om de capaciteit te verminderen en de geluidseigenschappen te verbeteren. Om dit te doen, houd je een kleine voorraad gesmolten was bij de hand. Oefen luchtdruk uit op de achterkant van de pipet om te voorkomen dat was in de punt komt.

Dompel vervolgens de punt kort in de vloeibare was. En verwijder nu. Plaats de pipet in het polijstapparaat en breng de punt ongeveer 50 micrometer van het filament. Houd er rekening mee dat het filament zal uitzetten wanneer het wordt verwarmd. Pas een korte warmtepuls van één of twee seconden toe om het was van de punt van de pipet te verwijderen en het glas glad te maken. Bekijk de pipetuiteinden onder een microscoop om de openingdiameter en gladheid te bepalen.

Voor standaard patch clamp opnames moeten de puntopeningen één tot drie micron in diameter zijn, gooi ruwe, ongelijke of onregelmatige punten weg. Plaats de voltooide pipet in een werkdoos, zorg ervoor dat je de deksel sluit om de pipetten te beschermen tegen stof, herhaal voor 10 succesvolle pipetten. Ik heb je net laten zien hoe je patch clamp pipetten en scherpe elektrodes kunt maken met behulp van een programmeerbare puller.

Dezelfde procedure kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan glasgereedschappen te maken, inclusief injectienaalden voor optimale patch clamp resultaten. Het is belangrijk om te onthouden om nieuwe stofvrije pipetten op dezelfde dag van het experiment te trekken en ze binnen een uur na het experiment te polijsten. Controleer ook door inspectie of de pipetten glad en gepolijst zijn.

Zorg ervoor dat je onze andere video bekijkt, waarin wordt gedemonstreerd hoe je patch clamp opnames van ionenkanalen kunt maken die tot expressie worden gebracht in opus oöcyten. Oké, dat is het. Nu ben je een pipetexpert en veel succes met je experimenten.