Name: Het maken van Patch-pipetten en Sharp elektroden met een programmeerbare Puller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Leer hoe u patch-pipetten en scherpe elektroden maakt met een programmeerbare puller voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze methode omvat waxcoating en vuurpolijsten voor optimale prestaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij bedanken de volgende financierende instanties en stichtingen voor ondersteuning: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, spierdystrofie Vereniging, de Donald B. en Delia E. Baxter Foundation, het Fonds en de Klingenstein McKnight Endowment for Neuroscience.

Pulling pipetten Met behulp van een micro-elektrode trekker, zoals de Sutter P-97 Flaming / Brown, trek een set van ongeveer 10-20 pipetten. <ol><li> Selecteer uw capillaire glas. We maken gebruik van borosilicaat capillairen (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm buitendiameter, binnendiameter 1.1mm, 10cm lang). Zorgvuldig op te slaan, zodat het glas blijft schoon en stofvrij. </li><li> Ontwerp een programma te trekken. We maken gebruik van een 5 stappen programma, met dalende hitte en snelheid bij elke stap, en een kleine trek aan de laatste stap. Sutter&#39;s pipet kookboek is een uitstekende referentie voor het ontwikkelen van geschikte programma&#39;s. </li><li> Onderzoek de pipetpunten onder een microscoop om de opening met een diameter en gladheid te bepalen. Gooi ruw, oneffen of onregelmatig tips. Een goede trekken protocol moet ervoor zorgen dat deze zeldzaam zijn. Voor standaard patch-clamp-opname, moet tip openingen 1-3 micrometer in diameter. Een steile taper (stompe punt) leidt tot weerstand lager voor dezelfde opening diameter. Vorm en grootte kan gewijzigd worden door druk polijsten. </li></ol> Brand polijsten pipetten <ol><li> Stel een polijsten rig (microforge) met een platina filament verwarming gecontroleerd door een voetpedaal. Een handige kit is verkrijgbaar bij ALA Scientific (CPM-2) of een soortgelijk apparaat kan stukje bij beetje worden gemonteerd. </li><li> Optioneel: Smeer de pipet met een isolator aan capaciteit verminderen en verbeteren van geluid kenmerken. We maken gebruik van tandartsen. Sylgard 184 ™ (poly-dimethyl siloxaan elastomeer ook wel bekend als PDMS) is ook een optie. </li><li> Bij gebruik van wax, houd een kleine gesmolten aanbod in de buurt. Met de luchtdruk op de achterkant van de pipet om de was te houden van het invoeren van de pipet, dip de punt kort in op de vloeibare was en te verwijderen. Met Sylgard, op te slaan bereid elastomeer in bevroren aliquots en verf de pipetpunt onder een microscoop. Warmte aan het elastomeer genezen. </li><li> Plaats de pipet (gecoat of niet) in het polijsten apparaat en breng het uiteinde ~ 50 micron van de gloeidraad. Houd er rekening mee dat de gloeidraad zal uitbreiden bij verhitting. </li><li> Aanbevolen: Volg de apart protocol voor &#39;druk polijsten &quot;om de vorm van de pipet voor een optimale weerstand en tip diameter te veranderen. </li><li> Een korte puls warmte (1-2 seconden) is voldoende om de was te verwijderen uit de punt van de pipet en het glas glad. </li><li> Plaats de pipet eindigde in een gesloten doos om te beschermen tegen stof, herhaal dit voor een succesvolle 10 pipetten. </li></ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

Het protocol geïllustreerde is hier in het dagelijks gebruik in de elektrofysiologie laboratoria en wordt ook gebruikt om injectienaalden te maken voor cellen en dieren. Met een programmeerbare trekker, is het gemakkelijk om pipetten te maken voor een scala van toepassingen. Met aandacht en zorg, zal de gloeidraad op uw trekker voor een jaar of meer. Veel succes met je experimenten.

<table><tbody><tr><td>Micropipettrekker</td><td>Instrument</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Of een vergelijkbaar instrument (bijv. Sutter P-87 of P-2000)</td></tr><tr><td>Glazen capillairen</td><td>Reagens</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>Of vergelijkbaar capillairglas. Gebruik een capillair met een glazen filament om het vullen van de pipet te vergemakkelijken.</td></tr></tbody></table>

het maken van patch-pipetten en sharp elektroden met een programmeerbare puller

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glazen micro-elektroden (ook wel pipetten) zijn een werkpaard van elektrofysiologie voor decennia. Vandaag de dag worden dergelijke pipetten gemaakt van glas haarvaten met behulp van een programmeerbare trekker. Dergelijke instrumenten warmte van de capillaire met behulp van een metalen filament of een laser en trekken uit het glas met behulp van de zwaartekracht, een motor of beide. Pipetten voor patch-clamp opnamen worden gevormd met alleen warmte en zwaartekracht, terwijl de scherpe elektroden voor intracellulaire opname gebruik maken van een combinatie van warmte, de zwaartekracht, en een motor. De procedure gebruikt om de intracellulaire opname pipetten te maken is vergelijkbaar met die gebruikt voor de injectie naalden voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder cRNA injectie in Xenopus oöcyten te maken. In het algemeen, capillaire glas &lt;1,2 mm in diameter wordt gebruikt om de pipetten voor patch clamp opname te maken, terwijl de smallere glas wordt gebruikt voor intracellulaire opname (buitendiameter = 1,0 mm). Voor elk gereedschap, is de trekker net iets anders geprogrammeerd. Deze video laat zien hoe je beide soorten van opname pipetten met behulp van vooraf vastgestelde puller programma&#39;s.

Deze video laat zien hoe u een programmeerbare trekker te gebruiken om patch pipetten en scherpe elektroden te maken voor elektrofysiologie. Dezelfde procedure kan gebruikt worden om een ​​verscheidenheid van glazen instrumenten, waaronder injectienaalden te maken.

Het maken van Patch-pipetten en Sharp elektroden met een programmeerbare Puller

Glazen micro-elektroden (ook wel pipetten genoemd) zijn al decennia lang een onmisbaar instrument in de elektrofysiologie. Tegenwoordig worden dergelijke pipetten gemaakt van glazen capillairen ...

Glazen capillaire pipetten zijn alomtegenwoordig geworden in laboratoria voor een breed scala aan technieken, zoals electroporatie van enkelvoudige cellen, DNA-microinjectie en patchclamp-elektrofysiologie. Om glazen capillaire patchclamp-elektroden voor registraties voor te bereiden, wordt silicaatglas uitgetrokken op een programmeerbare puller. De elektrotips worden gecoat met was, waarna de tips vlamgepolijst worden en worden bewaard voor toekomstig gebruik. Hallo, ik ben Miriam Goodman van de afdeling Moleculaire en Cellulaire Fysiologie aan de Stanford University.In deze video demonstreer ik hoe u patchclamp-pipetten en scherpe elektroden maakt voor elektrofysiologie. Glazen micro-elektroden, ook wel pipetten genoemd, zijn al decennia lang onmisbaar in de elektrofysiologie. Tegenwoordig worden deze pipetten gemaakt van glazen capillairen met behulp van een programmeerbare puller.Laten we beginnen. Om patchclamp-pipetten te maken, gebruiken we Sutter borosilicaatcapillairen die schoon en stofvrij zijn, en we maken gebruik van de Sutter P-97 flaming ground micro-elektrode puller. Het Pipette Cookbook van Sutter is een uitstekende referentie voor het ontwikkelen van geschikte pul

making-patch-pipettes-and-sharp-electrodes-with-a-programmable-puller

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit is een gids voor het wijzigen van de vorm van glas micropipetten. In het bijzonder door gebruik te maken van warmte en luchtdruk van de taper is verbreed zonder verhoging van de tip opening, wat leidt tot een lagere weerstand pipet. Dit is essentieel voor het lage geluidsniveau opnamen van kleine cellen te verkrijgen, maar is nuttig in tal van toepassingen.

Druk polijsten pipetten voor verbeterde patch-clamp opnemen

Planar lipidendubbellagen, ook wel kunstmatige lipidendubbellagen, kunt u om te studeren ionengeleidende kanalen in een goed gedefinieerde omgeving. Hier tonen we de individuele stappen die nodig zijn om de bilaag kamer voor te bereiden, de elektroden en hoe om te testen dat de bilaag is geschikt voor single-channel metingen.

Voorbereiding van de Kunstmatige dubbellagen voor Elektrofysiologie Experimenten

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid te meten. Het algemene principe van deze benadering is membraan vervorming te meten in reactie op welbepaalde negatieve druk aangebracht door een micropipet op het celoppervlak. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om biomechanische eigenschappen van substraat-aangehechte cellen te bestuderen.

Micropipet Aspiratie van substraat-attached Cellen to Cell Stijfheid Schatting

Iontoforese van neurale agonisten en antagonisten tijdens...

Productie en gebruik van Piggy-back Multibarrel Elektroden voor<em&gt; In vivo</em&gt; Farmacologische Manipulaties van neurale responsies

Multi-elektrode patch-clamp vormen een complexe taak. Hier laten we zien hoe, door het automatiseren van veel van de experimentele stappen is het mogelijk om het proces dat tot kwalitatieve verbetering van de prestaties en het aantal opnamen versnellen.

Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System

Bacteriële mechanosensitieve kanalen kunnen worden gebruikt als mechanoelectrical transducers in biomoleculaire inrichtingen. Droplet-interface dubbellagen (DIB), cel-geïnspireerde bouwstenen om dergelijke apparaten, vertegenwoordigen nieuwe platforms op te nemen en te stimuleren mechanosensitieve kanalen. Hier tonen we een nieuwe micropipet gebaseerde werkwijze voor het vormen van DIB, waardoor de studie van mechanosensitieve kanalen onder mechanische stimulatie.

Multifunctionele, Micropipet-gebaseerde methode voor opname en het stimuleren van bacteriële mechanosensitieve Ion Channels in Droplet Interface dubbellagen

We presenteren methoden voor de constructie van elektroden om gelijktijdig extracellulaire neurale activiteit op te nemen en meerdere neuroactieve stoffen in de buurt van de opnameplaatsen bij wakkere muizen vrij te geven. Deze techniek maakt de gedetailleerde analyse van veronderstelde lokale synaptische input naar de belangrijke neuron mogelijk.

Extracellulaire van neuronale activiteit Gecombineerd met Microiontophoretic Toepassing van neuroactive stoffen in Awake Muizen

Dit protocol beschrijft hoe u automatische beeldgeleide patch-clamp experimenten kunt uitvoeren met behulp van een systeem dat onlangs is ontwikkeld voor standaard in vitro elektrofysiologie apparatuur.

Toepassing van geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp voor de studie van neuronen in hersenschijven

We beschrijven een protocol om veranderingen in de activiteit van het afferente neuron te volgen tijdens motorische commando's in een model gewerveld haarcelsysteem.

Activiteit van Posterior Lateral Line Afferent Neurons tijdens het zwemmen in Zebrafish

Dit protocol beschrijft een methode voor het direct meten van ionkanaalactiviteit op intracellulaire blaasjes met behulp van een handmatig endolysosomaal patch-clamp-systeem. We illustreren de methode waarbij endolysosomen worden vergroot en deze blaasjes handmatig worden geïsoleerd. Deze aanpak zorgt ervoor dat onderzoekers de procedure nauwkeurig kunnen repliceren en toepassen.

Patch-clamp-technieken voor analyse van enkelvoudige endolysosomale blaasjes

Leer hoe u patch-pipetten en scherpe elektroden maakt met een programmeerbare puller voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze methode omvat waxcoating en vuurpolijsten voor optimale prestaties.

Het maken van Patch-pipetten en Sharp elektroden met een programmeerbare Puller

Meer video's verkennen