Olfactorische Behavioral Testen in de Adult Mouse

Het olfactorische systeem of reukvermogen van de Rodin-muis is een steeds populairder onderzoeksgebied geworden. Om de olfactorische gevoeligheid te testen, krijgt een muis de gelegenheid om te wennen in een kooi zonder bodembedekking, waarna deze wordt blootgesteld aan stukjes filterpapier die toenemende concentraties van een geurstof bevatten. De tijd die de muis besteedt aan het onderzoeken van het filterpapier wordt vervolgens geregistreerd.

Olfactorische preferentietests worden op exact dezelfde wijze uitgevoerd. Echter, in plaats van concentraties van de geurstof te verhogen, wordt de tijd genoteerd die de muis besteedt aan het onderzoeken van verschillende geurstoffen. Hallo, ik ben Rochelle Witt van het laboratorium van Dr. Rosalyn Siegel van de afdeling Neurobiologie aan de Harvard Medical School.

Hoi, ik ben Jennifer Deno, ook van het Siegel Lab. Vandaag laten we u twee procedures zien voor olfactorisch onderzoek. We gebruiken deze procedures in ons laboratorium om de olfactorische gevoeligheid en olfactorische voorkeur te bestuderen.

Laten we beginnen. Om de procedure voor het testen van de reukgevoeligheid te starten, neemt u vier schone kooien zonder strooisel. De kooien moeten 8 inch hoog, 10 inch breed en 18 inch lang zijn.

Zet de vier kooien in een veiligheidskast. Plaats vervolgens tussen elke arena scheidingswanden van ondoorzichtig filterpapier. Plaats daarna een zwart karton tegen de laatste scheidingswand, zodanig dat de zijkant en de bodem van de kooi bekleed zijn.

Zorg dat er licht in de arena valt door de bovenkant van de kooi af te dekken met een transparant stuk plexiglas. Begin nu met het habitueren van de proefpersonen. Plaats het eerste subject in de eerste kooi.

Verplaats na 15 minuten het eerste proefdier naar de tweede kooi. Maak de eerste kooi schoon met Quatra side tb. Plaats vervolgens het tweede proefdier in de eerste schoongemaakte kooi.

Zet dit proces voort met de volgende proefdieren voorafgaand aan de test. Plaats één van de proefdieren in de vierde kooi en laat deze nog 15 minuten wennen. Uiteindelijk moet er in elk van de eerste drie kooien een proefdier gewend zijn.

We zijn nu klaar om de geurmonsters voor te bereiden. De geurmonsters moeten worden voorbereid door een andere onderzoeker die niet op de hoogte is van het subject, de genotypen en/of de condities. Begin de monstervoorbereiding door een passend aantal vierkantjes filterpapier van twee bij twee inch te maken.

Maak vervolgens de juiste verdunningen van de vooraf geselecteerde geur in conische buizen. Houd er rekening mee dat verschillende genetische achtergronden van muizen mogelijk verschillende geurverdunningen vereisen voor een effectief onderscheid tussen een controlegroep en een experimentele groep. Vanwege deze observatie vinden wij het nuttig om de geschikte geurverdunningen empirisch te bepalen bij proefdieren die lijken op de controlegroep, voordat we overgaan tot het experimentele testen van naïeve muizen. Gebruik voor hydrofobe monsters, zoals pindakaas, olie als oplosmiddel en voor alle andere monsters een passend oplosmiddel.

Gebruik gedestilleerd water en een vortexmixer om ervoor te zorgen dat de verdunningen goed gemengd zijn. Plaats vervolgens een digitale videorecorder aan het uiteinde van de zuurkast, zodanig dat het gehele uiteinde van de kooi scherp in beeld is. Maak een proefvideo om te controleren of de camera-instellingen adequaat zijn.

Note in een laboratoriumjournaal de volgorde waarin de verdunningen worden getest, waarbij u erop let dat de volgorde in elke proef wordt gerandomiseerd. Noteer daarnaast het nest en de identificatienummers van het subject. Zodra het subject 15 minuten lang aan de arena is gewend, start u met de voorbereiding voor de eerste proef.

Pipetteer de eerste verdunning een aantal keer op en neer in de conische buis voordat u deze op een vierkant filterpapier pipetteert. Het oppervlak van het filterpapier moet optimaal voor ongeveer 85% bedekt zijn. Gebruik een Kim wipe om ervoor te zorgen dat het filterpapier niet oververzadigd is.

Nu het geparfumeerde filterpapier is voorbereid, kunnen we de eerste geurgevoeligheidstest uitvoeren. Start de video-opname om de test te beginnen. Plaats vervolgens het geparfumeerde filterpapier in de kooi aan de tegenovergestelde zijde van de huidige positie van het dier.

Start de timer. Stop na drie minuten de opname en verwijder de geur. Start vervolgens de timer opnieuw en bereid een tweede geurmonster voor.

Begin na één minuut met de video-opname. Plaats, zoals voorheen, de geurmonster in de kooi aan de tegenovergestelde zijde van de huidige positie van het dier. Herhaal deze procedure voor elke verdunning van het geurmonster en voor elk subject; vergeet niet het videobestandnummer voor elke trial te noteren.

Nu we de test voor olfactorische gevoeligheid hebben gedemonstreerd, gaan we over naar de test voor olfactorische voorkeur. Volg voor de test voor olfactorische voorkeur dezelfde procedure als beschreven voor de test voor olfactorische gevoeligheid, met uitzondering van twee kleine aanpassingen. Eén.

Bereid in plaats van meerdere verdunningen van één vooraf geselecteerde geur, zowel een attractieve als een aversieve geur voor. Ten tweede: noteer niet de te testen verdunning, maar de volgorde van de variaties die getest zullen worden, waarbij de volgorde in elke trial wordt gerandomiseerd. Alle overige stappen in de procedure zijn identiek aan de olfactorische testen, inclusief de habituatie van de proefpersonen, het gebruik van een geblindeerde onderzoeker, het aanbrengen van de geur op filterpapier en de getimede videoregistratie van elke trial.

Zodra de testen voor olfactorische voorkeur zijn voltooid, kan worden overgegaan tot het scoren van deze testen. Nadat alle video's van de olfactorische sensitiviteit en voorkeur zijn verzameld, wordt de totale tijd gescoord die het subject heeft besteed aan het verkennen van elke verdunning of geur om de consistentie te bepalen. Laat deze analyse uitvoeren door een onderzoeker die niet op de hoogte is van de groepsindeling (blinded researcher).

Het is nuttig om eerst de video voor te bekijken en op het volgende te letten: wanneer het filterpapier in de arena wordt geplaatst, wanneer de muis het filterpapier nadert, wanneer de muis het filterpapier onderzoekt, en wanneer er drie minuten zijn verstreken sinds het moment dat het filterpapier aanvankelijk in de arena is geplaatst. Door te weten waar u zich op het gedrag van de muis moet concentreren, is het eenvoudiger om bij het terugkijken de totale tijd van exploratie nauwkeurig te scoren. Bekijk nu de volledige video. Gebruik een stopwatch om alle onderzoeken binnen drie minuten na het plaatsen van het filterpapier in de arena te timen.

De onderzoekstijd wordt gedefinieerd als elke tijdsduur waarin de neus van de muis zich op minder dan één millimeter van het filterpapier bevindt; het is belangrijk om geen tijd mee te tellen waarin de muis zich wel in de nabijheid van het filterpapier bevindt, maar het niet actief onderzoekt. Neem episodes van kauwen en likken aan het papier, evenals episodes van op het papier zitten, niet mee in de totale exploratietijd. Houd deze regels strikt en consistent aan om het olfactorische gedrag nauwkeurig te kunnen analyseren.

Nadat de totale tijd die is besteed aan het onderzoeken van het filterpapier in de video-opname is geëvalueerd, dient de analyse voor alle video's te worden herhaald. Hier zijn representatieve resultaten van de olfactorische tests. Deze eerste grafiek toont de resultaten voor een sessie van olfactorische sensitiviteitstraining.

Elke muis uit zowel de experimentele groep B als de controlegroep A werd gedurende één sessie van drie minuten blootgesteld aan één van vijf verschillende verdunningen van kaneelextract op filterpapier. De totale tijd die werd besteed aan het verkennen van het filterpapier werd beoordeeld, en deze grafiek toont de resultaten van een sessie van olfactorische preferentietests. Elke muis werd gedurende één sessie van drie minuten blootgesteld aan elk van de verschillende geuren op filterpapier.

De totale tijd die werd besteed aan het verkennen van het filterpapier werd beoordeeld. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe de reukvermogens bij de volwassen muis kunnen worden getest; bij het gebruik van deze procedures is het belangrijk om naïeve muizen te gebruiken om de reukvermogens nauwkeurig te testen en niet andere vaardigheden zoals leren en geheugen. Dat was alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.