15.8: Mutageneza in vitro

Aby dowiedzieć się więcej o funkcji genu, naukowcy mogą obserwować, co się dzieje, gdy gen jest inaktywowany lub “znokautowany”, tworząc genetycznie zmodyfikowane zwierzęta nokautujące. Myszy z nokautem były szczególnie przydatne jako modele chorób ludzkich, takich jak rak, choroba Parkinsona i cukrzyca.

Przebieg procesu

Geny mogą być losowo eliminowane lub określone geny mogą być celowane. Aby znokautować konkretny gen, wykorzystuje się zmodyfikowany fragment DNA zwany wektorem docelowym, który zastępuje normalny gen, dezaktywując go w ten sposób.

Wektory celujące mają sekwencje na każdym końcu, które są identyczne – lub homologiczne – z sekwencjami flankującymi każdą stronę interesującego genu. Te homologiczne sekwencje pozwalają wektorowi docelowemu zastąpić gen poprzez rekombinację homologiczną – proces, który zachodzi naturalnie między DNA o podobnych sekwencjach podczas mejozy.

Wektor celujący jest wprowadzany do embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli przy użyciu metod takich jak elektroporacja – wykorzystanie impulsów elektrycznych do tymczasowego tworzenia porów w błonie komórkowej. Zazwyczaj, aby zidentyfikować komórki, w których wektor prawidłowo zastąpił gen, projektuje się go tak, aby zawierał marker selekcji pozytywnej – taki jak gen oporności na neomycynę (Neo^R) – między regionami homologicznymi; oraz marker selekcji negatywnej – taki jak gen wirusowej kinazy tymidynowej (TK) – po jednym z regionów homologicznych.

Komórki są wystawione na działanie neomycyny i tylko te, które włączyły wektor do swojego DNA, przeżyją, ponieważ mają gen Neo^R. Ponadto komórki, w których wektor zastąpił docelowy gen poprzez rekombinację homologiczną, nie będą miały genu TK, co pozwoli im przetrwać w obecności leku gancyklowiru. Dlatego ekspozycja na gancyklowir służy do eliminacji komórek, które mają wektor losowo wstawiony do ich genomu, ponieważ komórki te będą miały gen TK.

Komórki z prawidłowo wybitym genem są następnie wprowadzane do zarodka myszy, który jest wszczepiany do macicy samicy, gdzie rozwija się aż do urodzenia. Powstała w ten sposób mysz jest chimerą – co oznacza, że składa się z mieszaniny komórek – niektóre z normalnym DNA z zarodka, a niektóre z genem wybitym na jednym chromosomie z zmodyfikowanych komórek. Myszy te są hodowane, a potomstwo zawierające gen w linii zarodkowej jest dalej krzyżowane, aby stworzyć linię myszy, w której każda komórka jest homozygotyczna pod względem nokautu. Te myszy z nokautem mogą być następnie wykorzystane do badania funkcji genów.