15.8: Mutageneza in vitro

Aby dowiedzieć się więcej na temat funkcji genu, badacze mogą obserwować, co się dzieje, gdy gen zostanie inaktywowany lub ”znokautowany”, tworząc genetycznie zmodyfikowane zwierzęta z nokautem. Myszy z nokautem okazały się szczególnie przydatne jako modele chorób ludzkich, takich jak rak, choroba Parkinsona i cukrzyca.

Proces

Geny mogą zostać losowo wyeliminowane lub mogą zostać wybrane określone geny. Aby wyeliminować konkretny gen, stosuje się zmodyfikowany fragment DNA zwany wektorem kierującym, który zastępuje normalny gen, inaktywując go w ten sposób.

Wektory kierujące mają na każdym końcu sekwencje identyczne—lub homologiczne—z sekwencjami flankującymi każdą stronę genu będącego przedmiotem zainteresowania. Te homologiczne sekwencje umożliwiają wektorowi kierującemu zastąpienie genu poprzez rekombinację homologiczną — proces, który zachodzi naturalnie między DNA o podobnych sekwencjach podczas mejozy.

Wektor docelowy wprowadza się do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy, stosując metody takie jak elektroporacja — wykorzystanie impulsów elektrycznych do tymczasowego utworzenia porów w błonie komórkowej.Zazwyczaj, aby zidentyfikować komórki, w których wektor prawidłowo zastąpił gen, projektuje się go tak, aby zawierał marker selekcji pozytywnej — taki jak gen oporności na neomycynę (NeoR) — pomiędzy regionami homologicznymi; i marker selekcji negatywnej — taki jak gen wirusowej kinazy tymidynowej (TK) — po jednym z regionów homologicznych.

Komórki są wystawione na działanie neomycyny i tylko te, które włączyły wektor do swoDNA, przeżyją, ponieważ mają gen NeoR. Ponadto komórki, w których wektor zastąpił docelowy gen poprzez rekombinację homologiczną, nie będą miały genu TK, umożliwiającego im przeżycie w obecności leku gancyklowiru. Dlatego też narażenie na ganciclovir stosuje się w celu wyeliminowania komórek, do których genomu wprowadzono losowo wektor, ponieważ komórki te będą miały gen TK.

Komórki z prawidłowo usuniętym genem wprowadza się następnie do zarodka myszy, który wszczepia się do macicy samicy, gdzie rozwija się aż do porodu. Powstała mysz jest chimerą—co oznacza, że składa się z mieszaniny komórek — niektórych z normalnym DNA z embrionu, a innych z genem usuniętym na jednym chromosomie z zmodyfikowanych komórek. Te myszy są hodowane, a potomstwo zawierające gen w linii zarodkowej jest dalej krzyżowane w celu stworzenia linii myszy, w której każda komórka jest homozygotyczna pod względem nokautu. Te myszy z nokautem można następnie wykorzystać do badania funkcji genów.

Naukowcy mogą dezaktywować lub znokautować gen u zwierząt, zwykle myszy, aby dowiedzieć się więcej o funkcji genu, zwykle poprzez zastąpienie go wektorem docelowym, zmodyfikowanym fragmentem DNA.

Wektor docelowy ma sekwencje, które są homologiczne, identyczne z sekwencjami przed i po genie. Zwykle ma również marker selekcji pozytywnej, taki jak gen oporności na neomycynę NeoR w środku i marker selekcji negatywnej, taki jak gen kinazy tymidynowej TK na jednym końcu.

Po wprowadzeniu do embrionalnych komórek macierzystych zastępuje gen poprzez rekombinację homologiczną, która zachodzi naturalnie między odcinkami DNA o podobnych sekwencjach. Komórki, w których gen został prawidłowo zastąpiony, będą zawierały marker dodatni, ale nie ujemny, co pozwoli na ich identyfikację w hodowli. Komórki te są następnie wprowadzane do zarodka myszy i wszczepiane do macicy samicy. Powstała mysz ma kombinację normalnych komórek i komórek z genem wybitym na jednym chromosomie.

Myszy te są następnie hodowane w celu wytworzenia tak zwanych myszy z nokautem, które są homozygotyczne pod względem nokautu we wszystkich komórkach.