4.4:

4.4: Stała wiązania równowagi i siła wiązania

The Equilibrium Binding Constant and Binding Strength

JoVE Core
Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Core Molecular Biology

The Equilibrium Binding Constant and Binding Strength

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

4.3: Conserved Binding Sites

4.5: Cofactors and Coenzymes

12,729 Views

•

02:18 min

•

November 23, 2020

Overview

Stała wiązania równowagi (K_b) określa ilościowo siłę oddziaływania białko-ligand. K_bmożna obliczyć w następujący sposób, gdy reakcja jest w równowadze:

gdzie P i L są odpowiednio niezwiązanym białkiem i ligandem, a PL jest kompleksem białko-ligand.

Ponieważ ilość związanego liganda jest również związana z szybkością wiązania liganda, eksperymenty mogą również określić K_b, badając szybkość asocjacji białko-ligand (k_on) i dysocjacji (k_off) przy użyciu następującego stosunku:

W związku z tym do określenia stałej wiązania równowagi stosuje się dwie kategorie testów wiązania – te, które mierzą stężenia równowagowe i te, które mierzą kinetykę reakcji. W takim przypadku reakcja musi być w równowadze w czasie pomiaru.

Sposób wyznaczania stężeń równowagowych zależy od pożądanej czułości i łatwości wykrywania sygnału. Z tych powodów najczęściej stosowane są testy spektroskopowe. W tych eksperymentach reakcja powoduje zmianę absorbancji reagenta lub produktu o danej długości fali, wykrywalną przez spektrofotometr UV-Vis. Alternatywnie, reagent lub produkt może być oznaczony sondą fluorescencyjną lub może zawierać wewnętrzny fluorofor. Następnie postęp reakcji można zmierzyć na podstawie zmiany fluorescencji. Testy te są wykonywane poprzez zmianę stężeń jednego reagenta, podczas gdy reszta eksperymentu jest utrzymywana na stałym poziomie. Wyniki można następnie przedstawić na wykresie i przeanalizować za pomocą różnych metod dopasowywania krzywych.

Interakcje między białkami i ligandami są również badane przy użyciu różnych technik biochemicznych i spektroskopowych. Analiza strukturalna, wykorzystująca krystalografię rentgenowską i spektroskopię NMR, pomaga w przewidywaniu interakcji białko-ligand poprzez symulacje molekularne. Podejścia teoretyczne i obliczeniowe, takie jak badania dokowania białek-ligandów, są szeroko stosowane do charakteryzowania pozycji i interakcji ligandów małocząsteczkowych, w tym kandydatów na leki. Komputerowe wspomaganie projektowania leków jest szybką i tanią alternatywą przyspieszającą tempo konwencjonalnych testów leków metodą prób i błędów.

Transcript

W komórce białka losowo zderzają się z innymi cząsteczkami, takimi jak inne białka, kwasy nukleinowe i ligandy drobnocząsteczkowe.

Jeśli wiązanie jest niespecyficzne, kilka niekowalencyjnych oddziaływań między cząsteczkami powoduje krótkie skojarzenie.

Jeśli określony ligand wiąże się z białkiem, tworzy rozległe oddziaływania niekowalencyjne wzdłuż komplementarnych powierzchni. Takie kompleksy są stabilne, pozostają związane przez długi czas, zanim się rozłączą.

Siła oddziaływania wiązania jest podawana w postaci jego stałej równowagi, K_b, zwanej również stałą wiązania lub asocjacji.

K_b można obliczyć ze stosunku stężenia kompleksu białko-ligand do stężeń białka niezwiązanego i liganda znajdujących się w stanie równowagi.

Biorąc pod uwagę jego związek ze zmianą energii swobodnej spowodowaną wiązaniem, duże K_b oznacza duży spadek delta G, co wskazuje na silne powinowactwo między białkiem a ligandem.

Dwa konkurencyjne procesy są ważne dla wiązania białka-liganda: asocjacja białka i liganda w celu utworzenia kompleksu oraz dysocjacja kompleksu na reagenty.

Stała asocjacji, k_on, jest miarą liczby zdarzeń wiązania na sekundę między białkiem a jego ligandem; może być użyta do obliczenia szybkości wiązania liganda z białkiem przy danym stężeniu.

I odwrotnie, k_off jest miarą liczby zdarzeń dysocjacji; może być użyta do obliczenia, jak szybko kompleks się rozpada.

Gdy szybkość asocjacji jest równa szybkości dysocjacji, osiągana jest równowaga, w której stężenia netto produktów i reagentów pozostają stałe.

Zatem w stanie równowagi k_razy iloczyn stężeń równowagowych białka i liganda jest równy k razy stężenie równowagowe kompleksu białko-ligand.

Przegrupowanie tego wyrażenia pokazuje również, że stosunek k_on do k_off jest równy K_b w stanie równowagi.

Key Terms and definitions

Learning Objectives

Questions that this video will help you answer

This video is also useful for

Tags

Stała wiązania równowagi siła wiązania wiązanie niespecyficzne specyficzne wiązanie liganda oddziaływania niekowalencyjne stabilne kompleksy dysocjacja stosunek stężenia powinowactwo stała asocjacji Kon szybkość wiązania liganda stała dysocjacji Koff