7.16: Konserwatywna rekombinacja specyficzna dla miejsca i zmienności fazowej

Ponieważ segmenty DNA są cięte i reorganizowane w sposób specyficzny dla kierunku, rekombinacja specyficzna dla miejsca okazała się skuteczną techniką inżynierii genetycznej. Rekombinazy Flippazy i Cyklizacji, odpowiednio Flp i Cre, to dwaj członkowie rodziny rekombinaz tyrozynowych pochodzących z bakteriofagów, które są wykorzystywane do pośredniczenia w specyficznych dla miejsca insercjach, delecjach i ukierunkowanej ekspresji białek w liniach komórkowych ssaków.

Miejsca rozpoznawane przez rekombinazę Cre, zwane miejscami LoxP, mają długość około 34 par zasad. Miejsca LoxP zawierają sekwencje palindromowe o długości 13 bp, co oznacza, że sekwencja nukleotydów brzmi tak samo w kierunkach 5’ do 3’ i 3’ do 5’. Rekombinacja specyficzna dla miejsca, w której pośredniczą rekombinazy Cre, jest jedną z najpopularniejszych metod stosowanych w tworzeniu myszy transgenicznych z nabytymi mutacjami. Stosowanie termostabilnych wariantów rekombinazy Cre ze specyficznymi tkankowo promotorami pozwala na przestrzenną kontrolę nad ekspresją i działaniem rekombinazy Cre. Na przykład umieszczenie specyficznego dla nerek promotora kadheryny przed genem Cre umożliwia ekspresję enzymu tylko w tkankach nerek. W celu czasowej kontroli aktywności rekombinazy Cre gen enzymu ulega fuzji z domeną wiążącą ligand, tak że enzym ulega ekspresji tylko w obecności specyficznego liganda.

Głównym ograniczeniem w stosowaniu rekombinacji specyficznej dla miejsca jako narzędzia do edycji genomu jest to, że docelowe miejsce lub miejsca rekombinacji muszą być najpierw wstawione lub muszą być obecne przypadkowo. Jeśli można wstępnie wybrać miejsce genomowe zgodne z miejscem rozpoznawanym przez enzym, rekombinazy można zastosować ze specyficznością docelową „szytą na zamówienie”. W ostatnich badaniach wykorzystano mutagenezę i tasowanie genów do zaprojektowania wariantów Flp, które mogą funkcjonalnie rozpoznawać miejsca z mutacjami kombinatorycznymi. Wyniki są obiecujące dla przyszłych iteracji tasowania genów, które mogą dać bardziej specyficzne warianty Flp i mogą być wykorzystane komercyjnie jako narzędzie molekularne do inżynierii dużych genomów.

Rekombinacja specyficzna dla miejsca to rodzaj wymiany genetycznej, w której wyspecjalizowane enzymy zwane rekombinatami specyficznymi dla miejsca katalizują ruch odcinków DNA między zdefiniowanymi miejscami, które mają pewną homologię sekwencji.

Kiedy zachodzą takie ruchy, regiony, które mają być wymieniane, są zwykle otoczone parą symetrycznych sekwencji składających się z dwuniciowego DNA o długości około 20 do 30 par zasad.

Wyspecjalizowane enzymy zwane rekombinazami, które wiążą się z tymi sekwencjami, mogą należeć do rodzin rekombinaz seryny lub tyrozyny. Rodziny te mają albo resztę seryny, albo tyrozyny w miejscu aktywnym enzymu i wykorzystują różne mechanizmy.

W przypadku rekombinazy seryny podjednostki najpierw specyficznie wiążą się ze swoimi nowymi sekwencjami rozpoznawania, tworząc kompleks synaptyczny. Następnie seryna w miejscu aktywnym atakuje szkielet DNA fosfodiestrowego w centrum tych sekwencji, tworząc punkty przerwania znane jako miejsca skrzyżowania.

Następnie rekombinazy serynowe przetną wszystkie zaangażowane helisy DNA, zanim nastąpi wymiana nici.

W przeciwieństwie do tego, rekombinazy tyrozyny wiążą się w ten sam sposób, ale przecinają i łączą jedną nić dupleksu DNA na raz. Reszta tyrozyny następnie kowalencyjnie wiąże się z końcem 3' rozszczepionej nici, podczas gdy wolne grupy hydroksylowe 5' atakują wiązanie białko-DNA, tworząc pośrednie połączenie Holliday'a.

Ten złożony wzór jest pierwszym zdarzeniem crossoverowym. Następnie, gdy pozostałe nici DNA są rozszczepiane i wymieniane przez podjednostki rekombinazy w drugim zdarzeniu, połączenie Hollidaya jest przekształcane w produkty rekombinowane.

Istnieją trzy potencjalne skutki takich zdarzeń rekombinacji.

Pierwszą z nich jest integracja, w której kolista cząsteczka DNA zostaje wstawiona do drugiego, liniowego DNA.

Gdy oba miejsca znajdują się na tej samej cząsteczce DNA, drugim wynikiem może być wycięcie, w którym część wyciętego DNA jest po prostu usuwana, swobodnie integrując się w innym miejscu genomu.

W trzecim scenariuszu, jeśli miejsca nacięcia znajdują się w przeciwnych orientacjach, może dojść do odwrócenia - gdzie odcinek DNA jest usuwany, a następnie ponownie integrowany w przeciwnej orientacji.

Dobrze zbadanym przykładem tego zjawiska jest specyficzna dla miejsca inwersja segmentu chromosomalnego bakterii Salmonella, która pozwala jej wytwarzać dwa różne typy białka flageliny w zależności od środowiska, a proces ten nazywa się zmiennością fazy.