Konserwatywna rekombinacja specyficzna dla miejsca i zmienność fazowa

Ponieważ segmenty DNA są cięte i reorganizowane w sposób specyficzny dla kierunku, rekombinacja specyficzna dla miejsca stała się skuteczną techniką inżynierii genetycznej. Rekombinazy flippazy i cyklizacji lub odpowiednio Flp i Cre to dwaj członkowie rodziny rekombinaz tyrozynowych pochodzących z bakteriofagów, które są używane do pośredniczenia w insercjach DNA, delecjach i docelowej ekspresji białek w liniach komórkowych ssaków.

Miejsca rozpoznawania rekombinazy Cre zwane miejscami LoxP mają długość około 34 par zasad. Miejsca LoxP zawierają 13 sekwencji palindromicznych pz, co oznacza, że sekwencja nukleotydowa jest taka sama zarówno w kierunkach od 5′ do 3′, jak i od 3′ do 5′. Rekombinacja specyficzna dla miejsca, w której pośredniczą rekombinazy Cre, jest jedną z najpopularniejszych metod stosowanych w tworzeniu transgenicznych myszy z nabytymi mutacjami. Zastosowanie termostabilnych wariantów rekombinazy Cre z promotorami specyficznymi dla tkanek pozwala na przestrzenną kontrolę nad ekspresją i działaniem rekombinazy Cre. Na przykład, umieszczenie specyficznego dla nerek promotora kadheryny przed genem Cre pozwala na ekspresję enzymu tylko w tkankach nerkowych. W celu czasowej kontroli aktywności rekombinazy Cre gen enzymu jest łączony z domeną wiążącą ligand, tak że enzym ulega ekspresji tylko w obecności specyficznego liganda.

Głównym ograniczeniem w stosowaniu rekombinacji specyficznej dla miejsca jako narzędzia do edycji genomu jest to, że miejsce docelowe rekombinacji musi być najpierw wstawione lub musi być obecne przypadkowo. Jeśli można wstępnie wybrać miejsce genomowe zgodne z miejscem rozpoznawania enzymów, rekombinazy mogą być stosowane ze specyficznością docelową “na zamówienie”. W ostatnich badaniach wykorzystano mutagenezę i tasowanie genów do zaprojektowania wariantów Flp, które mogą funkcjonalnie rozpoznawać miejsca z mutacjami kombinatorycznymi. Wyniki są obiecujące dla przyszłych iteracji tasowania genów, które mogą dać bardziej specyficzne warianty Flp i mogą być wykorzystane komercyjnie jako narzędzie molekularne do inżynierii dużych genomów.