11.11: CRISPR i crRNA

Bakterie i archeony są podatne na infekcje wirusowe, podobnie jak eukarionty, dlatego opracowały unikalny adaptacyjny układ odpornościowy, aby się chronić. Skupione, regularnie rozmieszczone, krótkie powtórzenia palindromiczne i białka związane z CRISPR (CRISPR-Cas) są obecne u ponad 45% znanych bakterii i 90% znanych archeonów.

System CRISPR-Cas przechowuje kopię obcego DNA w genomie gospodarza i wykorzystuje ją do identyfikacji obcego DNA po ponownej infekcji. CRISPR-Cas ma trzy różne etapy ataku w przypadku infekującego ponowni wirusa. Na etapie akwizycji region protoprzerywnika wirusowego DNA jest rozcinany przez systemy CRISPR. Specyficzny region protoprzerywnika identyfikuje się do rozszczepienia za pomocą motywu sąsiadującego z protoprzerywnikiem (PAM) obecnego w docelowym wirusowym DNA. Rozszczepioną sekwencję protoprzerywnika następnie włącza się do bakteryjnego locus CRISPR. Na etapie ekspresji geny CRISPR i CAS ulegają transkrypcji w celu wytworzenia RNA pre-CRISPR (crRNA) i mRNA Cas. Pre-crRNA jest następnie przetwarzany w celu wytworzenia dojrzałego crRNA. Na etapie interferencji crRNA i przetłumaczone białko Cas tworzą kompleks rybonukleoproteinowy, który celuje i przecina wirusowy DNA w sposób specyficzny dla sekwencji.

Systemy CRISPR-Cas można podzielić na trzy różne typy charakteryzujące się typem białka Cas. W układach typu I Cas3 ma aktywność helikazy i nukleazy. Wiele dodatkowych białek Cas powoduje dwuniciowe pęknięcie wirusowego DNA. W układach typu II nukleaza Cas9 działa samodzielnie, rozcinając DNA. Oprócz crRNA systemy typu II zawierają również transaktywujący RNA CRISPR (tracrRNA), który jest wymagany do dojrzewania crRNA. W systemach typu III Cas10 pełni nieznaną funkcję, ale podobnie jak system typu I potrzebuje wielu białek do rozszczepienia DNA. System typu III może również nakierowywać RNA na rozszczepienie. Typ I i typ III występują zarówno u bakterii, jak i archeonów, podczas gdy do tej pory typ II znaleziono tylko u bakterii. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami edycji genomu, takimi jak enzymy restrykcyjne, system CRISPR-Cas jest prostszy w użyciu i może namierzać wiele genów w tym samym eksperymencie, dlatego też okazało się, że jest potężnym narzędziem inżynierii genetycznej i jest szeroko stosowane do modyfikacji genomu zarówno organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych.

Bakterie nieustannie borykają się z infekcjami bakteriofagów, wirusów, które infekują bakterie.

Aby poradzić sobie z tym zagrożeniem, bakterie wyewoluowały wyrafinowany adaptacyjny system odpornościowy znany jako system CRISPR-Cas, który niszczy DNA bakteriofagów w przypadku ponownego zakażenia.

System ten obejmuje trzy różne procesy – włączenie segmentu DNA bakteriofaga do genomu bakteryjnego, produkcję CRISPR RNA i białka Cas oraz rozszczepienie DNA bakteriofaga za pośrednictwem CRISPR RNA-Cas.

Kiedy bakteriofag atakuje, przyczepia się do powierzchni komórki bakteryjnej i wprowadza swoje DNA do bakterii, które jest następnie rozszczepiane przez system bakteryjny.

Krótki segment DNA bakteriofaga jest następnie dodawany do określonych regionów genomu bakteryjnego, zwanych CRISPR, zgrupowanych w regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeniach palindromicznych. Są to regiony genomu, w których powtórzenia sekwencji bakteryjnych przeplatają się z krótkimi, zmiennymi sekwencjami dystansowymi różnych bakteriofagów.

Te sekwencje dystansowe służą jako pamięć dla bakterii wszystkich bakteriofagów, które wcześniej zaatakowały. Bakterie wykorzystują sekwencje dystansowe do szybkiej identyfikacji i niszczenia DNA określonego typu bakteriofaga, jeśli zaatakuje ponownie.

Transkrypty z regionu CRISPR są przetwarzane w celu wytworzenia cząsteczek RNA CRISPR o długości około 30 nukleotydów, które zawierają sekwencję dystansową i pobliską sekwencję powtórzeń bakteryjnych.

Systemy związane z CRISPR lub Cas kodują białko Cas. To białko Cas następnie łączy się z cząsteczką RNA CRISPR, tworząc kompleks rybonukleoproteinowy.

Kiedy ten sam typ bakteriofaga atakuje ponownie, jego DNA jest rozpoznawane przez specyficzną sekwencję dystansową obecną w RNA CRISPR. Powiązane białko Cas następnie, samodzielnie lub za pomocą wielu białek, przecina obie nici DNA bakteriofaga.

Zasady działania systemu CRISPR-Cas i jego komponentów można wykorzystać do obalenia lub modyfikacji dowolnego genu w organizmie za pomocą jego komplementarnego przewodnika RNA.

Różne typy systemu CRISPR-Cas są obecne w bakteriach i archeonach. Wśród nich system CRISPR-Cas9 jest jednym z najlepiej przebadanych i szeroko stosowanych do różnych zastosowań praktycznych, ponieważ można go łatwo i skutecznie przeprogramować tak, aby celował w różne geny.