15.2: Izolacja DNA

Protokoły izolacji DNA mogą być szybkie i proste lub złożone i czasochłonne, w zależności od rodzaju i jakości DNA wymaganego do dalszego przetwarzania. Na przykład ekstrakcja plazmidowego DNA jest nieco bardziej skomplikowana niż ekstrakcja genomowego DNA ze względu na konieczność odpowiedniej metody lizy w celu oddzielenia plazmidowego DNA od gDNA podczas izolacji. Jednak w przypadku konkretnych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie DNA na duże odległości, które wymagają dobrej wydajności wysokiej jakości próbek DNA, musimy przestrzegać określonych protokołów, nawet w przypadku ekstrakcji genomowego DNA.

Rodzaje metod ekstrakcji genomowego DNA

Głównym celem metod ekstrakcji genomowego DNA jest oddzielenie gDNA od białek, RNA i innej zawartości komórki. Składa się z czterech podstawowych kroków – 1. Przerwanie struktury komórkowej mechanicznie lub przy użyciu chemikaliów w celu uzyskania lizatu komórkowego 2. Ochrona DNA przed degradacją podczas przetwarzania 3. Oddzielenie rozpuszczalnego DNA od szczątków komórkowych 4. Elucja oczyszczonego DNA.

Większość protokołów izolacji genomowego DNA to metody ekstrakcji oparte na roztworze lub do fazy stałej. Metody oparte na roztworach opierają się na etapach wytrącania i wirowania w celu oddzielenia DNA od innego materiału komórkowego, a następnie ekstrakcji organicznej lub “wysalania” w celu oddzielenia rozpuszczalnego DNA od białek komórkowych. Końcowe wytrącanie DNA odbywa się przy użyciu etanolu. Natomiast metody ekstrakcji do fazy stałej wykorzystują stałe podłoże, takie jak krzemionka lub matryce celulozowe, do wiązania DNA, a następnie mycia i elucji DNA ze stałego nośnika. Obejmuje odwirowanie, próżnię lub metody magnetyczne w celu oddzielenia związanego DNA od innych składników komórkowych.

Wybór metody ekstrakcji gDNA zależy od rodzaju próbki, liczby próbek, które mają być przetwarzane jednocześnie, oraz dalszego zastosowania DNA.