16.15: Profilowanie rybosomów

Profilowanie rybosomów lub sekwencjonowanie ryb to technika głębokiego sekwencjonowania, która pozwala uzyskać migawkę aktywnej translacji w komórce. Selektywnie sekwencjonuje mRNA chronione przez rybosomy, aby uzyskać wgląd w krajobraz translacji komórki w dowolnym momencie.

Zastosowania profilowania rybosomów

Profilowanie rybosomów ma wiele zastosowań, w tym monitorowanie translacji in vivo wewnątrz określonego typu narządu lub tkanki oraz ilościowe określanie poziomów syntezy nowych białek.

Technika ta pomaga zidentyfikować otwarte ramki odczytu i odkryć nowe produkty, w tym krótkie peptydy i izoformy scharakteryzowanych białek o nieznanych funkcjach. Profilowanie rybosomów pomaga również w identyfikacji kilku mRNA w komórce, które nie ulegają translacji, dopóki nie otrzymają sygnału zewnętrznego.

Wyzwania techniczne związane z profilowaniem rybosomów

Profilowanie rybosomów wiąże się z wieloma wyzwaniami technicznymi, takimi jak wymóg dotyczący dużych ilości próbek, niezawodność hamowania translacji w odpowiednim czasie i zanieczyszczenie RNA.

Technika błyskawicznego zamrażania może przezwyciężyć wyzwanie polegające na szybkim hamowaniu translacji. Pomaga skutecznie uchwycić rozkład rybosomów w komórkach w porównaniu z inhibitorami wydłużania translacji, takimi jak cykloheksymid.

Rybosomowy RNA (rRNA), które wiążą się z mRNA, są na ogół usuwane podczas profilowania rybosomów. Czasami jednak nadal obserwuje się kilka zanieczyszczeń rRNA. Naukowcy wykorzystują enzym nukleazę specyficzną dla dupleksu (DSN), aby zmniejszyć zanieczyszczenie rRNA wyizolowanym z wątrobowotrzustki kraba kamczackiego, które rozszczepia hybrydy dsDNA i DNA-RNA. Metodę tę często stosuje się również do normalizacji bibliotek cDNA przed sekwencjonowaniem nowej generacji i wyczerpaniem rRNA z bibliotek seq RNA.

Kolejnym ograniczeniem profilowania rybosomów jest analiza danych, która wymaga odpowiedniej wiedzy z zakresu bioinformatyki. Aby rozwiązać ten problem, stosuje się pakiet R riboSeqR, który zapewnia metody rozwiązywania danych profilowania rybosomów dla wielu próbek.

Identyfikacja regionów w genomie, które są transkrybowane i tłumaczone na białka, jest istotnym krokiem w zrozumieniu genomu i jego ekspresji.

Osiąga się to za pomocą techniki zwanej profilowaniem rybosomów, określanej również jako rybosekwencjonowanie. Mapuje pozycje rybosomów na mRNA i identyfikuje mRNA, które są aktywnie przekształcane w białka.

Aby wyizolować RNA, komórki muszą najpierw zostać poddane lizie, aby uzyskać dostęp do znajdujących się w nich cząsteczek. Lizat jest następnie traktowany RNazami. Enzymy te rozszczepiają mRNA, które nie są pokryte rybosomami, pozostawiając tylko chronione fragmenty mRNA.

Fragmenty chronione rybosomem są następnie oddzielane od niezabezpieczonych, rozszczepionych fragmentów za pomocą gradientu sacharozy.

Rybosomy są następnie usuwane z fragmentów mRNA, a RNA jest przekształcane w DNA za pomocą RT-PCR, przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy.

Następnie DNA jest sekwencjonowane i mapowane w genomie referencyjnym. Określa to dokładną lokalizację rybosomu wzdłuż każdego mRNA.

Profilowanie rybosomów może również pomóc w identyfikacji nierozpoznanych otwartych ramek odczytu lub ORF. ORF to region DNA między kodonem start a kodonem stop, który może ulec translacji na białko. Znalezienie ORF może być pomocne w identyfikacji nowych genów.

Weźmy pod uwagę badanie wzorców ekspresji genów w linii komórkowej ssaków. Procedura eksperymentalna polega na wystawieniu komórek na bodźce, które mogą włączyć ekspresję genów i zainicjować syntezę mRNA.

MRNA, które są aktywnie ulegane translacji, są identyfikowane za pomocą profilowania rybosomów.

Ten eksperyment ujawnia, że gen B ulega translacji, podczas gdy geny A i C nie.

Pokazuje również, że dodatkowy mały obszar genomu o długości około stu nukleotydów jest aktywnie translowany.

Ten nierozpoznany region jest otwartą ramką odczytu, która może kodować nowe białko, które jest regulowane w górę przez bodźce eksperymentalne.