16.15: Profilowanie rybosomów

Profilowanie rybosomów lub sekwencjonowanie rybosomów to technika głębokiego sekwencjonowania, która tworzy migawkę aktywnej translacji w komórce. Selektywnie sekwencjonuje mRNA chronione przez rybosomy, aby uzyskać wgląd w krajobraz translacyjny komórki w dowolnym momencie.

Zastosowania profilowania rybosomów

Profilowanie rybosomów ma wiele zastosowań, w tym monitorowanie in vivo translacji wewnątrz określonego narządu lub typu tkanki oraz ilościowe określanie nowych poziomów syntezy białek.

Technika ta pomaga zidentyfikować przetłumaczone otwarte ramki odczytu i odkryć nowe przetłumaczone produkty, w tym krótkie peptydy i izoformy scharakteryzowanych białek o nieznanych funkcjach. Profilowanie rybosomów pomaga również w identyfikacji kilku mRNA w komórce, które nie ulegają translacji, dopóki nie otrzymają sygnału zewnętrznego.

Wyzwania techniczne związane z profilowaniem rybosomów

Profilowanie rybosomów wiąże się z wieloma wyzwaniami technicznymi, takimi jak wymóg dużej ilości próbek, zależność od terminowego hamowania translacji i zanieczyszczenie RNA.

Technika błyskawicznego zamrażania może przezwyciężyć wyzwanie związane z szybkim hamowaniem translacji. Pomaga skutecznie uchwycić dystrybucję rybosomów w komórkach w porównaniu z inhibitorami wydłużenia translacji, takimi jak cykloheksymid.

Rybosomalny RNA (rRNA), który wiąże się z mRNA, jest na ogół usuwany podczas profilowania rybosomów. Czasami jednak nadal obserwuje się kilka zanieczyszczeń rRNA. Naukowcy wykorzystują enzym nukleazę specyficzną dla dupleksu (DSN) w celu zmniejszenia zanieczyszczenia rRNA, wyizolowanego z wątroby kraba kamczackiego, który rozszczepia hybrydy dsDNA i DNA-RNA. Metoda ta jest również często stosowana do normalizacji bibliotek cDNA przed sekwencjonowaniem nowej generacji i wyczerpaniem rRNA z bibliotek sekwencyjnych RNA.

Kolejnym ograniczeniem profilowania rybosomów jest analiza danych, która wymaga odpowiedniej wiedzy z zakresu bioinformatyki. Do rozwiązania tego problemu służy pakiet R ryboSeqR, który zapewnia metody rozwiązywania danych profilowania rybosomów dla wielu próbek.