32.8: Zasady chromatografii kolumnowej

Technika chromatograficzna została po raz pierwszy wynaleziona w 1901 roku przez Michaela S. Tswetta, rosyjskiego botanika, w celu oddzielania pigmentów roślinnych przy użyciu rozpuszczalników organicznych. Ponadto w 1941 roku Archer John Porter Martin i R. L. M. Synge zmodyfikowali tę technikę, umieszczając żel krzemionkowy w kolumnie. Następnie mieszaninę aminokwasów rozdzielono na kolumnie z wypełnieniem, stosując mieszaninę chloroformu i wody jako fazę ruchomą. Było to pierwsze doniesienie na temat chromatografii kolumnowej. Obecnie chromatografia kolumnowa jest szeroko stosowaną techniką rozdziału różnego rodzaju związków z mieszaniny próbek.

Czynniki wpływające na efektywną separację białek

Różne parametry, takie jak materiał kolumny, wypełnienie i warunki operacyjne, takie jak natężenie przepływu i temperatura, określają skuteczność rozdzielania metodą chromatografii kolumnowej.

Wybór materiału kolumny lub matrycy określa stopień interakcji z próbką. Materiał matrycy musi być szczelnie i równomiernie upakowany w kolumnie. Pęcherzyki powietrza, zanieczyszczenia, duże cząstki i osady zakłócają równomierny przepływ rozpuszczalnika przez kolumnę, wpływając na jej skuteczność separacji. Kolumna powinna być również wolna od cząstek stałych.

Próbka wstrzyknięta do kolumny powinna być klarowna i wolna od agregatów, które mogłyby zatykać kolumnę i utrudniać przepływ rozpuszczalnika. Natężenie przepływu rozpuszczalnika również wpływa na separację. Bardzo wysokie lub bardzo niskie natężenia przepływu rozpuszczalników powodują nieefektywne oddzielanie związków i zanieczyszczonych preparatów. Bardzo wysokie szybkości mogą również zakłócać upakowanie kolumny, wpływając na wydajność procesu. Ponadto ważnym czynnikiem jest także skład buforu do elucji. Powinien być niekorozyjny i kompatybilny z próbką, a także materiałem kolumny, aby zapobiec wytrącaniu się lub rozpuszczaniu in situ.

Ważną rolę w procesie odgrywa również inny parametr operacyjny, temperatura. Decyduje o stabilności próbki, materiału kolumny i buforu rozpuszczalnika. Ponadto stała temperatura w całej kolumnie skutecznie rozdziela związki. Po zakończeniu procesu separacji kolumny należy dokładnie umyć, wielokrotnie przepuszczając odpowiedni rozpuszczalnik, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki w dalszych seriach. Czasami rozpuszczalnik przepuszcza się przez kolumnę w odwrotnym kierunku, aby usunąć wszelki zatkany materiał.

Ograniczenia

Choć jest to bardzo szeroko stosowana technika, ma ona nadal pewne ograniczenia. Jest to metoda bardzo czasochłonna, ponieważ w celu lepszego rozdzielenia związków należy zmniejszyć natężenie przepływu. Ponadto duże ilości bardzo czystych rozpuszczalników wymaganych w fazie ruchomej powodują, że proces jest kosztowny. Zwiększa to również koszty zwiększania skali, gdy wymagana jest większa wydajność czystych związków.

Chromatografia kolumnowa to technika biochemiczna stosowana do rozdzielania związków na podstawie ich właściwości fizycznych i chemicznych.

Składa się z dwóch głównych składników - stałej fazy stacjonarnej lub matrycy i ciekłej fazy ruchomej lub rozpuszczalnika.

Kolumna wypełniona matrycą jest ładowana próbką, taką jak mieszanina białek. Rozpuszczalnik jest następnie używany do przenoszenia próbki przez kolumnę.

Wewnątrz kolumny matryca działa jak siatka molekularna filtrująca białka na podstawie ich wielkości lub interakcji z matrycą. Większe białka mają tendencję do przemieszczania się szybciej niż mniejsze białka, co skutkuje separacją opartą na wielkości.

Dodatkowo białka w próbce mogą wchodzić w interakcje z matrycą. Słabe oddziaływania umożliwiają białkom szybkie przechodzenie, podczas gdy silne oddziaływania zatrzymują białka w kolumnie.

Stopniowa zmiana pH lub siły jonowej rozpuszczalnika zmienia interakcje białek z matrycą i pomaga w elucji białek na oddzielne frakcje.