32.8: Zasady chromatografii kolumnowej

Technika chromatograficzna została po raz pierwszy wynaleziona w 1901 roku przez Michaela S. Tswetta, rosyjskiego botanika, do oddzielania pigmentów roślinnych za pomocą rozpuszczalników organicznych. Co więcej, w 1941 roku Archer John Porter Martin i R. L. M. Synge zmodyfikowali tę technikę, pakując żel krzemionkowy do kolumny. Mieszaninę aminokwasów oddzielono następnie na wypełnionej kolumnie, używając mieszaniny chloroformu i wody jako fazy ruchomej. Był to pierwszy raport na temat chromatografii kolumnowej. Obecnie chromatografia kolumnowa jest szeroko stosowaną techniką oddzielania różnego rodzaju związków z mieszaniny próbki.

Czynniki wpływające na efektywną separację białek

Różne parametry, takie jak materiał kolumny, upakowanie i warunki pracy, takie jak natężenie przepływu i temperatura, decydują o skuteczności separacji za pomocą chromatografii kolumnowej.

Wybór materiału kolumny lub matrycy określa zakres interakcji z próbką. Materiał matrycy musi być szczelnie i równomiernie upakowany w kolumnie. Pęcherzyki powietrza, zanieczyszczenia, duże cząstki i osady zakłócają równomierny przepływ rozpuszczalnika przez kolumnę, wpływając na skuteczność jego separacji. Kolumna powinna być również wolna od pyłu zawieszonego.

Próbka wstrzykiwana do kolumny powinna być przejrzysta i wolna od kruszyw, które mogłyby zatkać kolumnę, utrudniając przepływ rozpuszczalnika. Natężenie przepływu rozpuszczalnika również wpływa na separację. Bardzo wysokie lub bardzo niskie natężenia przepływu rozpuszczalników powodują nieefektywne oddzielanie związków i zanieczyszczonych preparatów. Bardzo wysokie dawki mogą również zaburzać upakowanie kolumny, wpływając na wydajność procesu. Ponadto ważnym czynnikiem jest również skład buforu elucyjnego. Powinien być niekorozyjny i kompatybilny z próbką, a także z materiałem kolumny, aby zapobiec wytrącaniu się lub rozpuszczaniu in situ.

Inny parametr operacyjny, temperatura, również odgrywa ważną rolę w tym procesie. Decyduje o stabilności próbki, materiału kolumny i buforu rozpuszczalnika. Ponadto stała temperatura w całej kolumnie skutecznie rozpuszcza związki. Po zakończeniu procesu rozdzielania kolumny muszą zostać dokładnie umyte poprzez wielokrotne przepuszczanie odpowiedniego rozpuszczalnika, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki w dalszych przebiegach. Czasami rozpuszczalnik jest przepuszczany w kolumnie w odwrotnym kierunku w celu usunięcia zatkanego materiału.

Ograniczenia

Chociaż jest to bardzo szeroko stosowana technika, metoda ta nadal ma pewne ograniczenia. Jest to bardzo czasochłonna metoda, ponieważ natężenia przepływu muszą być mniejsze, aby uzyskać lepszą rozdzielczość związków. Ponadto duże ilości wysoce czystych rozpuszczalników wymaganych w fazie mobilnej sprawiają, że proces ten jest kosztowny. Zwiększa to również koszty skalowania, gdy potrzebne są wyższe plony czystych związków.

Chromatografia kolumnowa to technika biochemiczna stosowana do rozdzielania związków na podstawie ich właściwości fizycznych i chemicznych.

Składa się z dwóch głównych składników - stałej fazy stacjonarnej lub matrycy i ciekłej fazy ruchomej lub rozpuszczalnika.

Kolumna wypełniona matrycą jest ładowana próbką, taką jak mieszanina białek. Rozpuszczalnik jest następnie używany do przenoszenia próbki przez kolumnę.

Wewnątrz kolumny matryca działa jak siatka molekularna filtrująca białka na podstawie ich wielkości lub interakcji z matrycą. Większe białka mają tendencję do przemieszczania się szybciej niż mniejsze białka, co skutkuje separacją opartą na wielkości.

Dodatkowo białka w próbce mogą wchodzić w interakcje z matrycą. Słabe oddziaływania umożliwiają białkom szybkie przechodzenie, podczas gdy silne oddziaływania zatrzymują białka w kolumnie.

Stopniowa zmiana pH lub siły jonowej rozpuszczalnika zmienia interakcje białek z matrycą i pomaga w elucji białek na oddzielne frakcje.