Światło / ciemność test przejścia dla Myszy

Summary

Światło / ciemność testu transformacji jest jednym z najczęściej stosowanych testów do pomiaru lęku zachowań w myszy. Poniżej prezentujemy film, który pokazuje szczegółowe procedury, w jaki sposób przeprowadzenia testu.

Abstract

Chociaż wszystkie sekwencje genomu myszy zostały określone, nie znamy jeszcze funkcje większość z tych genów. Gene-techniki kierowania, jednak mogą być używane do usuwania lub manipulowania określonego genu u myszy. Wpływ danego genu na specyficzne zachowanie może zostać określone poprzez przeprowadzenie analizy zachowań w zmutowanych myszy. Jako test dla zachowania fenotypowanie zmutowanych myszy, światło / ciemność testu transformacji jest jednym z najczęściej stosowanych testów do pomiaru lęku zachowań w myszy. Test oparty jest na naturalnych niechęć myszy na oświetlonych pomieszczeniach i na ich spontaniczne zachowania badawczych w nowych warunkach. Test jest wrażliwy na przeciwlękowe leczenia uzależnień. Urządzenie składa się z ciemności komory i komory jasno oświetlone. Myszy mogą swobodnie przemieszczać się między dwie komory. Liczba wpisów w jasne komorze i czas trwania czasu są wskaźniki jasne przestrzeni niepokój u myszy. Aby uzyskać fenotypowanie wyniki szczep zmutowanych myszy, które mogą być łatwo powielane i w porównaniu z tymi z innych mutantów, behawioralne metody badań powinny być identyczne, jak to możliwe między laboratoriami. Różnice proceduralne, które istnieją między laboratoriami, jednak sprawiają, że trudne do powtórzenia lub porównanie wyników między laboratoriami. Poniżej prezentujemy nasz protokół światło / ciemność testu przejścia jako film tak, że szczegóły protokołu można wykazać. W naszym laboratorium mamy oceniać więcej niż 60 szczepów zmutowanych myszy przy użyciu protokołu pokazane w filmie. Dane te będą przekazywane w ramach publicznej bazy danych, którą teraz budowę.

Wizualizacja protokołu ułatwi zrozumienie szczegóły całej procedury eksperymentalnej, co pozwala na standaryzację protokołów wykorzystywanych w laboratoriach i porównanie zachowań fenotypów z różnych szczepów zmutowanych myszy oceniano za pomocą testu.

Protocol

1. Urządzenie wykorzystywane do światła / ciemności testu przejścia składało się z klatki (21x42x25 cm) podzielony na dwie części równej wielkości przegrodą z drzwiami (Ohara & Co, Tokio).
2. Myszy są umieszczone 03:57 w klatce w pokoju z 12 godzin światło / ciemność cyklu (światła o godzinie 7:00) z dostępem ad libitum do jedzenia i wody. Najlepiej, dwie kontrolki i dwa mutanty są trzymane razem, przez reorganizację myszy tak szybko, jak są one genotyp w czasie karmienia piersią. Behawioralne badania odbywa się między 09:00 a 18:00 Wszystkie klatki zawierające myszy są przekazywane do pokoju testowego zachowanie 30 min przed pierwszym rozpoczęcia przewodu sądowego.
3. Jedna komora jest jasno oświetlone przez białe diody (390 luksów), podczas gdy druga komora jest ciemny (2 lux). Myszy są umieszczane w ciemną stronę i drzwi otwierane automatycznie po 3 sekundach od myszy jest wykrywany przez kamerę termowizyjną. Drzwi są używane tak, że myszy nie wchodzą świetle komory natychmiast po zwolnieniu z ich motywację do ucieczki od eksperymentatora, ponieważ opóźnienie, aby wejść do światła komory może służyć jako wskaźnik niepokoju, jak zachowanie.
4. Myszy mogą swobodnie przemieszczać się pomiędzy obiema izbami przy otwartych drzwiach do 10 min. Aplikacja służąca do pozyskiwania i analizowania danych behawioralnych (Image LD4) opiera się na wizerunku domeny programu J (opracowany byWayne Rasband w Narodowym Instytucie Zdrowia Psychicznego i dostępne w http://rsb.info.nih.gov/ij /), który został zmodyfikowany przez Tsuyoshi Miyakawa (dostępne poprzez O'Hara & Co, Tokio, Japonia).
5. Odległości przebytej w każdej komorze, całkowita liczba przejść, czas spędzony w każdej komory, a opóźnienia wejść świetle chamberare rejestrowane Obrazek LD4 programu.
6. Po każdym badaniu, wszystkie komory są czyszczone z super podchlorawego wody, aby uniknąć stronniczości w oparciu o sygnały węchowe.

Discussion

Chociaż wszystkie sekwencje genomu myszy zostały określone, funkcje większości z tych genów nie są znane. Gene-techniki kierowania, jednak mogą być używane do usuwania lub manipulowania określonego genu u myszy (Aiba et al, 2007;. Austin i wsp., 2004).. Wpływ danego genu na specyficzne zachowanie może zostać określone poprzez przeprowadzenie analizy zachowań w zmutowanych myszy (Takao i Miyakawa, 2006;. Takao i wsp., 2007). Jako test dla zachowania fenotypowanie zmutowanych myszy, światło / ciemność testu transformacji jest jednym z najczęściej stosowanych testów do pomiaru lęku zachowań w myszy (Crawley, 2000). Test oparty jest na naturalnych niechęć myszy na oświetlonych pomieszczeniach i na ich spontaniczne zachowania badawczych w środowiskach powieści (Crawley, 1985). Test jest wrażliwy na przeciwlękowe leczenia uzależnień (Crawley, 1985). Urządzenie składa się z ciemności komory i komory jasno oświetlone. Ograniczone otwarcie, 3 cm wysokości i szerokości 5 cm, łączy dwie komory. Myszy mogą swobodnie przemieszczać się między dwie komory. Liczba wpisów w jasne komorze i czas trwania czasu nie są używane jako wskaźniki w jasnych przestrzeni niepokój u myszy.

Światło / ciemność testu przejścia została opracowana przez Crawley i wsp. (Crawley i Goodwin, 1980). Istnieją dwie różnice pomiędzy ich oryginalną wersję, a nasz test. Po pierwsze, światło komory jest większa niż ciemnej komorze w wersji oryginalnej, natomiast wielkość komór jest tym samym w naszej wersji testu. Po drugie, w oryginalnej wersji, światło komory nie miał sufitu i ścian światła komory były przejrzyste (Crawley i Goodwin, 1980), podczas gdy używamy nieprzezroczysty biały plastik na suficie i ścianach światła komory. Te różnice, a mianowicie wielkość i otwartość światła komory, pozwalają na jednoczesne wykrywanie niepokój jasne-space, jak i open-space niepokój w oryginalnej wersji testu. W naszym laboratorium, jednak open-space niepokój zachowań w myszy jest testowany w uniesionego labiryntu plus. Nieprzezroczystych ścian i sufitu, wielkość światła komory i nasze specyficzne światło / ciemność protokół testu przejścia jest bardziej wyspecjalizowanych w wykrywaniu jasne przestrzeni niepokój w porównaniu do pierwotnej wersji.

Chociaż światło / ciemność testu przejścia i podwyższonej oraz labirynt są używane do oceny lęku-jak zachowanie, wyniki nie zawsze są spójne. Na przykład, przodomózgowia specyficzne myszy kalcyneuryny nokaut spędzić zmniejszył ilość czasu w świetle komory w światło / ciemność testu przejścia, ale przez dłuższy okres czasu w otwarte ramiona w uniesionego labiryntu plus (Miyakawa et al., 2003) . Zakładamy, że nasze światło / ciemność testu przejścia labiryntu i podwyższony oraz testów oceny różnych aspektów lęku jak zachowania, takie jak jasne przestrzeni niepokój i lęk otwartej przestrzeni jak zachowanie. Aby sprawdzić tę hipotezę, zastosowano duży zestaw danych zebranych przy użyciu tej samej myszy w obu testach. W naszym laboratorium prowadzimy badania dotyczące zachowań baterie wielu domen do ekranu dla zachowania znaczenia genów. Test baterii wymaga kilku tygodni. W okresie testowania, klatkach myszy są przechowywane na stojaku w naszym obiekcie. Jeśli myszy są transportowane do laboratorium z innych instytucji, są przyzwyczajone do środowiska naszego obiektu przez co najmniej 1 tydzień. Po okresie przyzwyczajenia, myszy poddawane są ogólne kontrole i badania neurologiczne (Miyakawa et al., 2003), i po tych prostych badań, myszy poddano światło / ciemność testu przejścia. Badanie przeprowadzane jest w dźwiękoszczelne pomieszczenie eksperymentalne po 30 min przyzwyczajenia do pomieszczeniu doświadczalnym, jak pokazano w filmie.

Oceniliśmy ponad 60 odmian genetycznie zmutowanych myszy przy użyciu protokołu przedstawiono w filmie i duży zestaw surowych danych dla ponad 3000 myszy (w tym typu dzikiego i myszy mutant). Przeprowadzono analizy czynników, aby skorzystać z dużego zbioru danych pierwotnych. Rzeczywiście, wykryliśmy różnych czynników, z każdego z nich (dane niepublikowane), chociaż zdarzały się istotne korelacje pomiędzy wskaźnikami (dane niepublikowane) .. Dane te będą przekazywane w ramach publicznej bazy danych, którą teraz budowę.

W naszym test baterii, typu dzikiego miotu są zwykle używane jako kontrola. Jako szczep tło, myszy C57BL/6J są powszechnie używane. Zebraliśmy dane z myszy C57BL/6J używany jako kontrola zmutowanych myszy z baterii testów. Wskaźników uzyskanych od myszy C57BL/6J w naszym światło / ciemność testu przejścia były następujące (n = 795, średnia SEM), przebytej odległości: 846,5 8,88 cm w świetle komory, 1478,5 9,53 cm w ciemnej komorze, czas trwania czasu : 215.8 1.85 s w świetle, 395.8 1.86 s w ciemności, liczba przejść pomiędzy komorami: 30,52 0,43; opóźnienia wejść do światła komory: 64,94 2,40 s. Ruch myszy wokół wejść do komór jest wykrywany przez aparat i jest liczony jako czas spędzony w obu chambers. Z tego powodu suma Średni czas czas spędzony w świetle i że w ciemnych pomieszczeń była większa niż w całym okresie badania (600 s).

W protokole, myszy zostały wprowadzone w ciemnej komorze. Trzy sekundy po umieszczeniu myszy w ciemnej komorze, drzwi między izbami automatycznie otwiera i myszy mogą swobodnie przemieszczać się pomiędzy dwie komory. Myszy C57BL/6J spędzać mniej czasu w świetle komory niż w ciemnej komorze (p <0,0001, czas trwania, jeśli czas spędzony w świetle: 215.8 1.85 s, wymiar czasu spędził w ciemności: 316.3 2.11 s [czas spędzony w ciemności nie nie obejmuje początkowej czas spędzony w ciemności przed wejściem do światła komory po raz pierwszy], n = 795, w połączeniu t-test). Oznacza to, że myszy C57BL/6J unikają światła komory, i że czas spędzony w świetle jest dobrym wskaźnikiem zachowania podobne do niepokoju.

Wyniki uzyskane z różnych szczepów zmutowanych myszy w prosty sposób porównywać, ponieważ wszystkie dane są uzyskiwane za pomocą tego samego protokołu. Aby uzyskać fenotypowanie wyniki szczep zmutowanych myszy, które mogą być łatwo powielane i porównano z danymi z innych mutantów, behawioralne metody badań powinny być identyczne, jak to możliwe między laboratoriami. Crabbe i współpracownikami przetestował interakcji między zachowaniem myszy i warunkach laboratoryjnych przy użyciu dokładnie takie same szczepy wsobne i jeden pusty zmutowany szczep. W tym badaniu, aparat, protokoły badań i wielu zmiennych środowiskowych zostały rygorystycznie znormalizowane. Pomimo standaryzacji, okazało się systematyczne różnice w zachowaniu w laboratoriach, ale także różnice wykryto szczep we wszystkich zachowań (Crabbe et al., 1999). Twierdzili oni, że niekontrolowane zmienne i eksperymentów charakteryzujące mutantów może przynieść wyniki, które są specyficzną dla danego laboratorium. Różnice proceduralne, które istnieją między laboratoriami sprawiają, że trudne do powtórzenia lub porównanie wyników między laboratoriami. Poniżej prezentujemy nasz protokół światło / ciemność testu przejścia jako film tak, że szczegóły protokołu można wykazać.

Ustanowienie dokumentacji wizualnej protokołu ułatwi lepsze zrozumienie szczegółów procedury doświadczalnej, co pozwala na standaryzację protokołów wykorzystywanych w laboratoriach i dla porównania zachowania fenotypów z różnych szczepów zmutowanych myszy oceniano za pomocą testu. Filmy z innych protokołów, takich jak uniesionego labiryntu plus, otwartych badań terenowych, porsolt teście wymuszonego pływania, klimatyzacja strachu, że używamy w naszych behawioralnych test baterii są obecnie starania o publikacji przyszłych artykułów w czasopismach wideo.