Badanie złożonych zachowań lokomocyjnych u Drosophila melanogaster zależy od możliwości ilościowego określenia zmian w ruchu danej muchy. Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzić ten proces przy użyciu wysokorozdzielczego systemu śledzenia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokorozdzielcze śledzenie wideo lokomocji u dorosłych osobników Drosophila melanogaster
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Muchy stanowią istotny model do badania złożonych zachowań ze względu na bogactwo narzędzi genetycznych dostępnych dla badaczy w tej dziedzinie. Badanie zachowań lokomocyjnych uDrosophila melanogasteropiera się na możliwości ilościowego określenia zmian w ruchu podczas lub w odpowiedzi na dane zadanie. Z tego powodu system śledzenia wideo o wysokiej rozdzielczości, taki jak opisany w niniejszej pracy, jest cennym narzędziem do pomiaru lokomocji w czasie rzeczywistym. Nasz protokół obejmuje zastosowanie wstępnego impulsu powietrza w celu zatrzymania pędu much, a następnie trzydziestosekundowy okres filmowania w kwadratowej komorze. Następnie wykorzystuje się program do śledzenia, aby obliczyć chwilową prędkość każdej muchy w komorze w odstępach 10 msec. Oprogramowanie analityczne kompiluje te dane i generuje szereg parametrów, takich jak średnia prędkość, prędkość maksymalna, czas spędzony w ruchu, przyspieszenie itp. W niniejszym protokole omówiono prawidłowe karmienie i utrzymywanie much do zadań behawioralnych, obchodzenie się z muchami bez znieczulenia lub unieruchomienia, przygotowanie kontrolowanego środowiska oraz przeprowadzanie testu od początku do końca.
Protokół
Część 1: Karmienie i hodowla much
- Muchy należy hodować w butelkach zawierających standardowe podłoże bez drożdży. Ze względu na potrzebę uzyskania dużej liczby osobników, krzyżówki należy zaplanować odpowiednio. Muchy powinny być hodowane w 12-godzinnym cyklu światło:ciemność w temperaturze 25ºC.
- Muchy należy zbierać krótko po wykluciu (1-3 dni). Na tym etapie z muchami można pracować przy użyciu dyfuzora dwutlenku węgla; należy je posegregować do probówek zawierających podłoże autoklawowane lub bezdrożdżowe. Stosujemy wyłącznie samce, przechowując po 10 osobników w jednej probówce.
- Przed przystąpieniem do eksperymentów behawioralnych należy odczekać co najmniej dzień lub dwa od zastosowania dwutlenku węgla. Testy behawioralne przeprowadzamy 3-5 dni po wykluciu.
- Analizy powinny być zawsze wykonywane w tym samym 2-3 godzinnym przedziale czasowym każdego dnia, aby uniknąć problemów związanych z rytmem okołodobowym.
Część 2: Konfiguracja systemu śledzenia w kontrolowanym środowisku
- Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze 25ºC i wilgotności 70%.
- Nad obszarem rejestracji należy zawiesić cyfrową kamerę wideo (obiektywem skierowanym w dół). Ponieważ nasze oprogramowanie do śledzenia opiera się na kontraście, kamerę zawieszamy nad pulpitem świetlnym. Kamera nagrywa filmy bezpośrednio na komputer Dell poprzez połączenie FireWire. Do akwizycji wideo używamy cyfrowej kamery wideo Sharp podłączonej do komputera Dell z programem Windows Moviemaker (wersja Vista).
- W niniejszym protokole będą podawane impulsy powietrza, dlatego w pomieszczeniu musi znajdować się źródło przepływu powietrza. Za pomocą gumowego wężyka należy połączyć źródło powietrza z filtrem węglowym w celu filtracji powietrza.
- Używając kolejnego gumowego wężyka, należy połączyć drugą stronę filtra węglowego z kolbą Erlenmeyera za pomocą pustego w środku gumowego korka, a następnie napełnić kolbę wodą do poziomu około pół cala. Pozwoli to na nawilżenie powietrza.
- Kolba powinna posiadać odnodogę, która zostanie połączona gumowym wężykiem z zaworem w kształcie litery Y.
- Jedno ramię zaworu Y powinno być podłączone do przepływomierza. Drugie ramię powinno dostarczać powietrze do kwadratowej komory lokomocyjnej.
Część 3: Przenoszenie much do komory lokomocyjnej
- Kwadratowa komora lokomocyjna opiera się na projekcie Wolf et al. 20021, z dodaniem małych tacek opadowych, aby zapobiec lataniu much wewnątrz komory. Przed użyciem należy rozłożyć komorę na części, a wszystkie komponenty dokładnie przetrzeć 70% etanolem i osuszyć.
- Zastosowanie anestezji bezpośrednio przed przeprowadzeniem testu behawioralnego może potencjalnie wpłynąć na wyniki. Aby tego uniknąć, muchy są delikatnie wprowadzane do komory za pomocą lejka z małym otworem wylotowym. Aby przygotować otwór o odpowiedniej wielkości, należy przymocować niebieski końcówkę pipety (do P1000) do końca lejka. Używając nożyczek, należy odciąć sam koniec końcówki pipety, aby otwarcie było wystarczająco duże, by mucha mogła przez nie przejść.
- Górna część naszej komory to mały kawałek pleksiglasu zabezpieczony śrubami wokół krawędzi. Po wyjęciu śrub otwory mogą służyć do wprowadzania much do komory. Należy ustawić pleksiglasowy top tak, aby otwór po śrubie znajdował się bezpośrednio nad wewnętrzną komorą, zamiast w miejscu, gdzie zwykle znajduje się śruba. Należy wziąć probówkę z muchami i umieścić ją dnem do góry nad lejkiem, który następnie należy włożyć w otwór po śrubie.
- NIE wolno przesuwać lejka, ponieważ mogłoby to zranić lub uszkodzić muchy. Zamiast tego należy delikatnie uderzać w całą komorę wraz z lejkiem, aż wszystkie muchy znajdą się wewnątrz komory. Uderzanie powinno odbywać się na podkładce pod mysz, aby zamortyzować wstrząsy. Gdy muchy znajdą się w środku, należy usunąć lejek i ponownie ustawić pleksiglasowy top nad gniazdami śrub. Następnie należy przykręcić pleksiglasowy top na miejsce.
Część 4: Przeprowadzenie testu aktywności lokomocyjnej
- Po prawidłowym umieszczeniu much w komorze, należy pozostawić je na 30 minut w celu aklimatyzacji. Okres aklimatyzacji powinien odbywać się w kontrolowanym środowisku (25ºC, 70% wilgotności), a komora powinna być ustawiona na pudełku świetlnym (które musi być włączone). Należy wyłączyć pozostałe światła w pomieszczeniu.
- Po okresie aklimatyzacji należy przełączyć zawór Y w systemie przepływu powietrza tak, aby powietrze kierowało się wyłącznie do przepływomierza. Należy uruchomić dopływ powietrza i stopniowo zwiększyć jego prędkość do pożądanej wartości (4,0-6,0 L/min). Zazwyczaj stosujemy 5,0-5,5 L/min, jednak każda prędkość w tym zakresie będzie odpowiednia.
- Po osiągnięciu pożądanej prędkości przepływu powietrza należy przełączyć zawór Y tak, aby powietrze wpłynęło do komory lokomocyjnej. Impuls powietrza powinien trwać 15 sekund, po czym należy gwałtownie wyłączyć dopływ powietrza. W momencie wyłączania powietrza należy przełączyć kamerę w tryb nagrywania. (Ta część wymaga praktyki, aby wykonać obie czynności jednocześnie).
- Nagrywanie należy zatrzymać po upływie pożądanego czasu i ZAPISAĆ plik. Nagrywamy próby trwające 30 sekund przy 10 klatkach na sekundę (przynajmniej 8 prób na genotyp).
Część 5: Analiza nagrań wideo
- Do śledzenia ruchu wykorzystujemy oprogramowanie Dynamic Image Analysis System (DIAS) w wersji 3.22. Aby móc skorzystać z tego programu, najpierw konwertujemy nagrania wideo do formatu plików AVI za pomocą programu Quicktime 7.5.5.
- Do śledzenia much na podstawie kontrastu stosujemy funkcję „Autotrace by Threshold”. Następnie wykorzystujemy funkcję „Make Path from Trace”, aby zdigitalizować te ślady.
- W celu wygenerowania prędkości chwilowych każdej muchy używamy funkcji „Compute Parameters”, która tworzy plik bazy danych (specyficzny dla DIAS). Korzystając z tej funkcji, wygładzamy również dane, stosując okno wygładzania Tukeya (Tukey Smoothing Window) o parametrach „5,15,60,15,5”.
- Po wyeksportowaniu tych informacji do pliku bazy danych można go otworzyć w programie Microsoft Excel. Używamy skryptu Matlab do zestawienia prędkości chwilowych w arkuszu Excel oraz do obliczenia dodatkowych parametrów niezbędnych do zrozumienia dynamiki ruchu i struktury serii (bout structure).
Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne zapisy z organizmów typu dzikiego Canton S (Rysunek 1, panel lewy) oraz much z mutacją null w genie dCASK, uzyskanych poprzez krzyżowanie dwóch dużych, nakładających się delecji (Df(3R)x307 i Df(3R)x313) (Rysunek 1, panel prawy). Wcześniej wykazano, że muchy z mutacją null dCASK wykazują problemy lokomocyjne w paradygmacie Buridana3, a w naszym paradygmacie, w porównaniu do Canton S, wykazują one znacznie zmniejszoną aktywność lokomocyjną. Zawsze w pierwszej kolejności badamy organizmy typu dzikiego, aby upewnić się, że warunki i zachowanie mieszczą się w normalnym zakresie w danym dniu. Odchylenia od standardowych odpowiedzi obserwowaliśmy w mniej niż 5% dni testowych. Różnice te można zazwyczaj przypisać problemom z parametrami naszej kontrolowanego środowiska.
Rycina 1. Ślady wygenerowane przez system DIAS dla much typu dzikiego Canton S (u góry, po lewej) oraz much z mutacją null dCASK z deficytem lokomocyjnym, powstałych w wyniku nakładających się delecji (u góry, po prawej). Ślady odzwierciedlają obraz widoczny na nagraniach wideo. Oba zdjęcia zawierają ślady od 8–10 much, których ruch był rejestrowany przez 30 sekund w teście śledzenia wideo po podaniu impulsu powietrznego.
Rycina 2. Muchy typu dzikiego poddano testowi lokomocyjnemu (powyżej) po podaniu impulsu powietrznego (słupki fioletowe) oraz bez impulsu powietrznego (kolor niebieski). we wszystkich parametrach obliczonych przez program analityczny nie stwierdzono istotnych różnic między dwiema warunkami (ustalono za pomocą obustronnego testu t-Studenta). Dowodzi to, że po podaniu impulsu powietrznego muchy poruszają się w naszej aparaturze w sposób prawidłowy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W naszej konfiguracji impuls powietrza o umiarkowanej sile przejściowo zatrzymuje ruch much. Po ustaniu impulsu powietrza muchy zostają uwolnione ze stanu spoczynku i poruszają się normalnie, co przedstawiono na rysunku 2. Ponieważ impuls powietrza skutecznie synchronizuje lokomocję populacji, wykorzystujemy go do rozpoczęcia próby, co pozwala nam również badać moment rozpoczęcia ruchu po bodźcu hamującym pęd. Test można jednak przeprowadzić bez impulsu powietrza, ponieważ parametry lokomocji po inicjacji ruchu nie są pr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant National Institutes of Health R01 GM54408 przyznany L.C. Griffith. Chcielibyśmy podziękować Fredowi Wolfowi za całą pomoc w zaprojektowaniu kwadratowej komory i przygotowaniu testu, Frankowi Mello z warsztatu maszynowego Uniwersytetu Brandeis za zbudowanie komory oraz Danowi Valentemu i Timowi Lebestky'emu za pomocne rozmowy dotyczące kwestii analitycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Komora kwadratowa | Narzędzie | Machine Shop | N/D | Projekt według Wolf et al. 20021 |
| Aparat cyfrowy | Aparat | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Przepływomierz | Narzędzie | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Pudełko do doświetlania | Narzędzie | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Filtr węglowy | Narzędzie | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Oprogramowanie | Soll technologies | N/D | www.solltechnologies.com |
Bibliografia
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
