Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Podsumowanie

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.

Streszczenie

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis, po której następuje mikroskopia elektronowa (EM) cienkich przekrojów, stanowi doskonały system do badania transportu nukleocytoplazmatycznego. Ze względu na dużą wielkość jądra oraz wysoką gęstość kompleksów porów jądrowych (NPCs), transport jądrowy można łatwo zwizualizować w oocycie Xenopus. Dzięki wykorzystaniu tego systemu uzyskano wiele istotnych informacji na temat mechanizmów importu i eksportu jądrowego (przegląd opracowany przez Panté, 2006). Ponadto wykorzystaliśmy mikroiniekcję oocytów Xenopus do analizy szlaków importu jądrowego kilku wirusów, które replikują się w jądrze gospodarza.

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus z substratem importu jądrowego. Przedstawiamy również przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii przekrojów cienkich, obejmujące wycinek, odwodnienie oraz zatopienie oocytów w żywicy epoksydowej. Na koniec prezentujemy reprezentatywne wyniki dla oocytów, do których wstrzyknięto kapsyd bakulowirusa Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) lub parwowirusa Minute Virus of Mice (MVM), oraz omawiamy potencjalne zastosowania tej techniki.

Protokół

Część 1: Przygotowanie oocytów Xenopus do mikroiniekcji

1. Umieść mały fragment (około 2 cm) jajnika Xenopus laevis w probówce stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml roztworu kolagenazy (5 mg/ml kolagenazy w zmodyfikowanym roztworze soli Bartha pozbawionym wapnia: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO₄, 10 mM Hepes, pH 7,5). Kolagenaza służy do usunięcia komórek pęcherzykowych otaczających oocyty.
2. Umieść probówkę na platformie wytrząsowej i delikatnie wstrząsaj (przy 100 RPM) przez jedną godzinę. Czas ten różni się w zależności od partii kolagenazy. Dlatego po godzinie pobierz małą próbkę oocytów i obejrzyj je pod mikroskopem stereologicznym. Prawidłowo odfolikulowane oocyty powinny być od siebie dobrze oddzielone, a wprowadzenie szklanej igły do oocytu powinno być łatwe. Jeśli oocyty nie są wystarczająco odfolikulowane, pozostawia się je w roztworze kolagenazy i sprawdza ponownie co pięć minut.
3. Przemyj oocyty trzykrotnie zmodyfikowanym roztworem soli Bartha (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO₄, 0,33 mM Ca(NO₃)₂, 0,41 mM CaCl₂, 10 mM Hepes, pH 7,5) i przenieś je do szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej MBS z dodatkiem 1% penicyliny/streptomycyny. Oocyty są teraz gotowe do mikroiniekcji. Jeśli mikroiniekcja ma być przeprowadzona w innym dniu, przechowuj oocyty w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia.
4. Pod mikroskopem stereologicznym wybierz do mikroiniekcji dojrzałe oocyty w stadium VI. Oocyty te są duże, z wyraźnym kontrastem między czarną półkulą zwierzęcą a kremową półkulą roślinną.
5. Przenieś dojrzałe oocyty w stadium VI do płytki z mikrowydziałami (Nunc, objętość studzienki 10 µl). Należy to zrobić ostrożnie, używając pipety 200-µl z końcówką, której koniec został odcięty, aby umożliwić zasysanie oocytów bez ich uszkodzenia.

Część 2: Mikroiniekcja oocytów Xenopus

1. Przygotować substrat do importu przeznaczony do mikroiniekcji, dodając niewielką ilość 1% błękitu bromofenolowego w celu ułatwienia wizualizacji procesu wstrzykiwania. Na przykład dodajemy 1 µl błękitu bromofenolowego do 10 µl substratu.
2. Umieścić niewielki pasek Parafilmu na szalce Petriego o średnicy 100 mm i nanieść na niego kroplę 5 µl roztworu do wstrzyknięcia.
3. Napełnić uprzednio skalibrowaną igłę do iniekcji (wykonaną poprzez wyciągnięcie mikropipety Drummond o pojemności 6,6 µl za pomocą urządzenia Inject+Matic Puller) roztworem do wstrzyknięcia. W tym celu mikroinjektor ustawia się w trybie aspiracji. Aby skalibrować igłę do iniekcji, należy nanieść na nią kropki co 0,5 mm, co odpowiada objętości 50 nl.
4. W przypadku iniekcji cytoplazmatycznej końcówkę igły wprowadzić do oocyta w półkuli wegetatywnej, bardzo blisko półkuli zwierzęcej, pod kątem około 45 stopni. Przełączyć ustawienie mikroinjektora na tryb mikroiniekcji i wstrzyknąć do każdego oocyta 50 nl substratu do importu. Kropki na igle służą do monitorowania ilości wstrzykniętego substratu.
5. Przenieść wstrzyknięte oocyty do małej szalki Petriego (o średnicy 35 mm) wypełnionej MBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez wybrany czas (punkty czasowe dobiera się tak, aby umożliwić obserwację substratu importowanego związanego z NPC; w przypadku białek i wirusów transportowanych aktywnie w kierunku NPC proces ten zachodzi między 10 a 30 minutami; czas ten zależy również od miejsca iniekcji oraz wielkości białka/wirusa).
6. Po zakończeniu inkubacji przenieść oocyty do szklanej fiolki o pojemności 4 ml zawierającej 2% glutaraldehydu w MBS i utrwalić przez noc w temperaturze 4 °C.

Część 3: Disekcja oocytów Xenopus

1. Następnego dnia przemyć oocyty 3 razy buforem MBS.
2. Przenieść oocyty do małej szalki Petriego wypełnionej buforem niskosolnym (LSB: 1 mM KCl, 0.5 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH 7.5). Za pomocą mikroskopu stereoskopowego i pęset sekcyjnych usunąć biegun wegetatywny z każdego oocytu. Wygodne jest stabilizowanie preparowanego oocytu jedną pęsetą, podczas gdy druga służy do odcięcia bieguna wegetatywnego. Na tym etapie można ocenić sukces mikroiniekcji na podstawie obecności niebieskiego zabarwienia w cytosolu. Protokół kontynuuje się tylko dla oocytów, które zostały skutecznie poddane mikroiniekcji. Ponadto, jeśli próbki mają być przygotowane do EM, ten etap sekcji znacznie ułatwia zlokalizowanie jądra podczas przycinania i krojenia próbek.
3. Ponownie utrwalić wypreparowane oocyty w 2% glutaraldehydzie w LSB przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Po utrwalaniu przemyć wypreparowane oocyty trzy razy buforem LSB.

Część 4: Przygotowanie wstrzykniętych oocytów do zatopienia i cięcia na cienkie sekcje do EM

1. Przenieść wypreparowane oocyty na szkiełko z zagłębieniem. Odessać jak największą ilość płynu, a następnie szybko (aby uniknąć wysychania) pokryć wypreparowane oocyty 2% niskotopliwą agarozą. Dopóki agaroza jest jeszcze miękka, użyć końcówki pipety, aby rozdzielić oocyty od siebie i upewnić się, że każdy oocyt jest skierowany stroną górną lub dolną (nie bokiem).
2. Pozostawić agarozę do zastygnięcia na około 10 minut. Po zastygnięciu agarozy użyć żyletki, aby pociąć ją na małe fragmenty, z których każdy zawiera jeden wypreparowany oocyt.
3. Umieścić oocyty zatopione w agarozie w szklanej fiolce o pojemności 4 ml i przeprowadzić postfiksację w 1% OsO₄ w buforze LSB przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Przemyć próbkę trzykrotnie w buforze LSB. W razie potrzeby przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez noc i kontynuować protokół następnego dnia.
5. Przeprowadzić sekwencyjną dehydratację próbek w rosnących stężeniach alkoholu (etanol 50, 70 i 90% przez 20 min każdy). Następnie zastosować dwie wymiany w 100% etanolu przez 15 min każda. Na koniec zdezhydratować próbki w 100% acetonie przez 15 min.
6. Infiltrować próbki mieszaniną Epon (Fluka) i acetonu w stosunku 1:1 przez jedną godzinę, następnie mieszaniną Epon i acetonu w stosunku 2:1 przez dwie godziny, a na koniec w czystym Eponie przez co najmniej sześć godzin.
7. Umieścić próbki w płaskich formach do zatapiania wypełnionych świeżym, czystym Eponem. Oocyty należy zorientować w taki sposób, aby strona jądra bliższa miejscu iniekcji – w tym przypadku strona oocytów, która została wypreparowana – była przecinana jako pierwsza. Krok ten optymalizuje szansę na wizualizację importu wybranego substratu.
8. Na koniec polimeryzować Epon przez dwa dni w temperaturze 60 °C.
9. W celu wizualizacji próbek, bloki należy przyciąć, a następnie wykonać skrawki przy użyciu ultramikrotomu. Skrawki przenosi się na siatki EM, barwi zgodnie ze standardową procedurą i wizualizuje za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Ta część protokołu nie zostanie przedstawiona, ponieważ jest to standardowa procedura EM.

Część 5: Reprezentatywne wyniki:

Jeśli protokół przebiegł pomyślnie, otoczka jądrowa (NE) oraz kompleksy porów jądrowych (NPC) powinny być wyraźnie widoczne na mikrografiach EM. W zależności od wstrzykniętego substratu oraz czasu pomiędzy wstrzyknięciem a utrwaleniem, substrat powinien być widoczny po stronie cytoplazmatycznej NPC, wewnątrz NPC lub po stronie jądrowej NPC.

Rycina 1 przedstawia przekrój poprzeczny otoczki jądrowej (NE) z przyległymy cytoplazmą (c) i jądrem (n) oocyty Xenopus, do której wstrzyknięto kapsydy bakulowirusa AcMNPV, inkubowanej w temperaturze 4°C przez cztery godziny i poddanej procesowi zatapiania oraz cięcia na cienkie sekcje do EM zgodnie z opisem. Groty strzałek wskazują na kompleksy porów jądrowych (NPC). Kapsyd dokujący do cytoplazmatycznej strony NPC zaznaczono białą strzałką.

W przeciwieństwie do poprzedniego przypadku, na Rysunku 2 przedstawiono przekrój poprzeczny osłonki jądrowej (NE) z przyległym cytoplazmą (c) i jądrem (n) z oocyta Xenopus, do którego wstrzyknięto parwowirusa Minute Virus of Mice (MVM), inkubowanego w temperaturze pokojowej przez cztery godziny i poddanego procesowi zatopienia oraz przygotowania cienkich przekrojów do EM zgodnie z opisem. Stosując tę technikę, stwierdziliśmy, że MVM indukuje przerwanie ciągłości NE (Cohen i Panté, 2005). Nawiasy wskazują przerwy w NE. Groty strzałek wskazują kompleksy porów jądrowych (NPC). Domniemane kapsydy MVM związane z NE są wskazane białymi strzałkami.

Rysunek 1: Mikrograf elektronowy przekroju otoczki jądrowej (NE) z sąsiadującą cytoplazmą (c) i jądrem (n) z oocyta Xenopus, do którego wstrzyknięto kapsydy bakulowirusa AcMNPV, inkubowanego w 4°C przez cztery godziny i poddanego procesowi zatapiania i przygotowania cienkich sekcji do EM zgodnie z opisem. Groty strzałek wskazują na kompleksy porów jądrowych (NPCs). Kapsydy zaznaczono białymi strzałkami. Pasek skali: 100 nm.

Rysunek 2: Mikrograf elektronowy przekroju otoczki jądrowej (NE) z przylegającym cytoplazmą (c) i jądrem (n) z oocytu Xenopus, do którego wstrzyknięto parwowirusa Minute Virus of Mice (MVM), inkubowanego w temperaturze pokojowej przez cztery godziny i poddanego procesowi zatapiania oraz cienkiego cięcia do EM zgodnie z opisem. Grotowidkie strzałki wskazują kompleksy porów jądrowych (NPCs). Nawiasy wskazują przerwy w NE. Przypuszczalne kapsydy MVM związane z NE zaznaczono białymi strzałkami. Pasek skali: 100 nm.

Dyskusja

Mikroiniekcja oocytów Xenopus w połączeniu z EM na cienkich przekrojach stanowi wysoce skuteczne narzędzie do badania transportu nukleocytoplazmatycznego. System ten był wykorzystywany do mapowania poszczególnych etapów importu przez NPC, na przykład oddziaływania substratu importu jądrowego z komponentami strukturalnymi NPC, takimi jak filamenty cytoplazmatyczne i koszyk jądrowy (przegląd Panté, 2006). Wykorzystywano go również do badania importu jądrowego wirusów replikujących się w jądrze (Panté i Kann, 2002;...