Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niezbędnym narzędziem do badania roli genu podczas rozwoju jest możliwość przeprowadzania badań nad wyciszaniem (knockdown), nadekspresją oraz błędną ekspresją genów. U danio pręgowanego (Danio rerio), mikroiniekcja RNA, DNA, białek, oligonukleotydów antysensownych i innych małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka zapewnia badaczom szybki i niezawodny test do analizy funkcji genówin vivoW niniejszym artykule wideo zademonstrujemy, jak przygotować i mikroiniekowaćin vitrosyntetyzowany mRNA EGFP oraz blokujący translację oligonukleotyd morfolinowy przeciwkopkd2, genu związanego z autosomalną dominującą wielotorbielowatością nerek (ADPKD), do embrionów rybek danio w stadium 1 komórki. Następnie przeanalizujemy skuteczność mikroiniekcji mRNA i morfolino poprzez weryfikację ekspresji GFP oraz analizę fenotypu. Szerokie zastosowania tej techniki obejmują tworzenie zwierząt transgenicznych i chimer linii zarodkowej, mapowanie losów komórek oraz screening genowy. W niniejszym dokumencie opisujemy protokół nadekspresji EGFP oraz knockdownupkd2poprzez wstrzyknięcie mRNA i oligonukleotydów morfolinowych.
Protokół
Część 1: Przygotowanie mikropipet oraz płytek komory do mikroiniekcji
- Wykonaj mikropipety poprzez podgrzewanie i wyciąganie kapilarnych rurek ze szkła borokrzemianowego (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) w urządzeniu do wyciągania mikropipet (Sutter Instruments Inc., Flaming/Brown P-97). Przechowuj je w szalce Petri na niewielkiej ilości gliny lub taśmy klejącej.
- Wlej 1,5% agarozę (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) w 1x medium E3 do płytek z uformowanymi klinowatymi wgłębieniami, które posłużą jako łatwy sposób unieruchomienia embrionów podczas iniekcji (opisane w 'The Zebrafish Book") 1. Pozostaw płytki z komorami agarowymi do stężenia przed użyciem i przechowuj w temperaturze 4ºC.
Część 2: Przygotowanie RNA
Jedną z potężnych metod badania funkcji genów jest mikroiniekcja transkrybowanego in vitro RNA z czapką do zarodków ryb danio pręgowanych. RNA z czapką zachowuje się podobnie do eukariotycznych mRNA występujących in vivo dzięki obecności analogu CAP. Badacze ryb danio pręgowanych rutynowo wykorzystują tę metodę w celu nadekspresji lub błędnej ekspresji badanego genu. W niniejszej demonstracji przeprowadzimy mikroiniekcję transkryptu znakowanego EGFP i wykorzystamy ekspresję GFP w żywych całych zarodkach jako widoczny wskaźnik pomyślnej iniekcji.
- Przeprowadź reakcję transkrypcji RNA z czapeczką (CAP RNA) in vitro dla wybranego transkryptu. W naszym laboratorium rutynowo wstawiamy cDNA interesujący nas gen w wektor pCS2+ i przeprowadzamy reakcję syntezy in vitro dużych ilości RNA z czapeczką, wykorzystując zestaw mMessage mMachine SP6 (Ambion, Inc., AM1340).
- Oczyść próbkę RNA, przepuszczając ją przez zestaw RNeasy Mini (Qiagen, Inc., 74104) lub stosując ekstrakcję fenol:chloroform oraz precypitację izopropanolem.
- Dokładnie określ stężenie preparatu RNA i przechowuj w temperaturze -80ºC do momentu użycia.
- W dniu iniekcji rozmroź próbkę RNA, lekko wymieszaj w wirówce typu vortex i krótko odwirowuj.
- Przygotuj roztwór roboczy w sterylnej wodzie z końcowym stężeniem 0,025 - 0,050% czerwieni fenolowej (Sigma-Aldrich Co., P0290). Czerwień fenolowa służy jako marker wizualny potwierdzający wstrzyknięcie roztworu do zarodka. W niniejszym artykule przygotujemy roztwór roboczy mRNA EGFP o stężeniu 100 ng/uL z 0,050% czerwieni fenolowej.
- Próbkę roboczą przechowuj w lodzie, a zapas RNA przenieś z powrotem do -80°C.
- Przejdź do Części 4, gdy będziesz gotowy do iniekcji tej próbki.
Część 3: Przygotowanie morfolino
Antysensowne oligonukleotydy morfolinowe są szeroko stosowane do modyfikacji ekspresji genów poprzez blokowanie translacji docelowego białka lub modyfikację splicingu pre-mRNA 2,3. Morfoliny u danio pręgowanego stanowią potężne narzędzie genetyki odwrotnej, umożliwiając wyciszenie funkcji genu. W niniejszym artykule przeprowadzimy mikroiniekcję oligonukleotydu morfolinowego skierowanego na miejsce inicjacji translacji genu pkd2 (5′-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3′). W oparciu o wcześniej opublikowane prace oczekujemy, że zaaplikowane embriony będą fenotypowo przypominać ryby mutanty pkd24.
- Zwyczajowo zamawiamy 300 nmol oligonukleotydu morpholino, zaprojektowanego specyficznie dla genu zainteresowania, z firmy Gene Tools, LLC (Philomath, OR).
- Dodaj 100 uL sterylnej wody, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 3 mM. Rozdziel roztwór na alikwoty i przechowuj w temperaturze -20°C do momentu użycia.
- W dniu iniekcji podgrzewaj roztwór morpholino w temperaturze 65°C przez 5 minut. Natychmiast schłodź w lodzie i krótko wiruj. Krok ten denaturuje ewentualne struktury drugorzędowe oligonukleotydu i zapewnia całkowite rozpuszczenie roztworu.
- Przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając roztwór morpholino w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 0,025 - 0,050% czerwieni fenolowej. W niniejszej demonstracji przygotujemy roztwór roboczy morpholino pkd2 o stężeniu 0,50 mM z 0,050% czerwieni fenolowej.
- Przechowuj roztwór roboczy w temperaturze pokojowej.
- Przejdź do Części 4, gdy będziesz gotowy do iniekcji tej próbki.----
Część 4: Napełnianie mikropipety roztworem roboczym
- Odciąć dystalną końcówkę mikropipety za pomocą pęsety lub chirurgicznej żyletki, aby stworzyć otwór widoczny pod mikroskopem stereoskopowym (Nikon Instruments, Inc., SM2645) przy powiększeniu 50X.
- Nanieść 2 uL roztworu roboczego w postaci kropli na szkiełko nakrywkowe.
- Przymocować tylną część mikropipety do strzykawki 5 mL wyposażonej w dren na igle hipodermicznej i lekko zanurzyć dystalną końcówkę mikropipety w kropli roztworu roboczego. Należy uważać, aby nie złamać końcówki mikropipety.
- Zassać roztwór roboczy przez dystalny koniec mikropipety, cofając tłok strzykawki.
Część 5: Kalibracja objętości iniekcji mikropipety
- Nanieś kroplę oleju mineralnego (American Bioanalytical, Inc., AB00921-00025) na szkiełko mikrometryczne (Fisher, 12-561-SM1).
- Włącz zasilanie oraz dopływ powietrza do aparatu mikrowstrzykiwacza impulsowego (World Precision Instruments Inc., PV830).
- Zamocuj mikropipetę w uchwycie mikropipet mikrowstrzykiwacza. Mikrowstrzykiwacz jest regulowany ciśnieniowo, a wstrzykiwanie jest aktywowane poprzez naciśnięcie pedału nożnego.
- Pod mikroskopem sekcyjnym sprawdź objętość wstrzykiwania, używając mikrowstrzykiwacza do naniesienia kropli roztworu roboczego na olej mikrometryczny. Zmierz średnicę kropli, która unosi się w formie sfery na powierzchni oleju.
- Dostosuj czas trwania i ciśnienie wstrzykiwania, aby precyzyjnie skalibrować objętość iniekcji. Krok ten wspomaga powtarzalność eksperymentu z mikrowstrzykiwania. W niniejszej demonstracji wszystkie mikrowstrzyknięcia będą wykonywane z średnicą kropli wynoszącą 0,15 mm (objętość około 1,76 nL).
- Po skalibrowaniu objętości wstrzykiwania użyj pokrętła „Hold” w mikrowstrzykiwaczu, aby zapobiec cofaniu się cieczy i wyciekom z mikropipety.
Część 6: Przygotowanie zapłodnionych zarodków danio pręgowanego do mikroiniekcji
- Zebry będą się losowo rozmnażać w ciągu pierwszych kilku godzin każdego ranka. Należy zebrać embriony w stadium 1 komórki i umieścić je w medium E3 1x.
- Za pomocą pipety transferowej 3 mL (Becton Dickinson Labware, 357524) należy ułożyć embriony wzdłuż klinowatych rynien w płytkach do komory mikroiniekcyjnej.
- Należy usunąć medium w taki sposób, aby embriony były płytko zanurzone, a nie zalane. Krok ten ułatwia osiadanie embrionów na dnie rynien, a także penetrację chorionu przez mikropipetę.
Część 7: Mikroiniekcja przez chorion
- Manipuluj zarodkami za pomocą mikropipety tak, aby cytoplazma zarodka w stadium 1-komórkowym była widoczna pod mikroskopem stereoskopowym. Uważaj, aby nie złamać końcówki mikropipety.
- Przebij mikropipetą chorion, a następnie żółtko, aby wykonać iniekcję do zarodka. W tej demonstracji najpierw wykonamy mikroiniekcję do żółtka bezpośrednio pod komórką, pozwalając, aby przepływ cytoplazmy i dyfuzja wprowadziły roztwór roboczy do wnętrza komórki. Przepływ ten jest widoczny dzięki dodatkowi czerwieni fenolowej do roztworu roboczego.
- Zademonstrujemy również bezpośrednią iniekcję do cytoplazmy komórki. Bezpośrednia mikroiniekcja do komórki jest bardziej skuteczna, ale czasochłonna, ponieważ wymaga prawidłowej orientacji zarodka i odpowiedniej techniki mikroiniekcji. Ponieważ błona komórkowa jest bardziej odporna niż błona żółtka, często szybciej jest wprowadzić mikropipetę przez żółtko, aby dotrzeć do cytoplazmy komórki. Pomocne w tej metodzie iniekcji może być skierowanie bieguna zwierzęcego w stronę dna korytka oraz pewność ruchów dłoni.
- Po mikroiniekcji umieść zarodki w szalce Petriego z medium E3 i inkubuj je w temperaturze 28.5°C w celu zapewnienia prawidłowego rozwoju.
- W ciągu kolejnych kilku godzin i dni rozwoju zarodkowego obserwuj zarodki pod kątem interesujących Cię fenotypów.
Część 8: Reprezentatywne wyniki
Nadekspresja mRNA EGFP: Aby zweryfikować powodzenie mikroiniekcji, będziemy monitorować ekspresję GFP w rozwijających się embrionach począwszy od stadium tarczy (~6 hpf) za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii całego embrionu in vivo (Leica Microsystems GmBh, MZFLIII). Ekspresja konstruktu jest najsilniejsza podczas wczesnych etapów rozwoju embrionalnego i często słabnie w trakcie rozwoju, w miarę stopniowej degradacji wstrzykniętego RNA z czapeczką, co zależy od stabilności ekspresowanego białka.
pkd2 translational-blocking morpholino: W oparciu o wcześniej opublikowane wyniki oczekujemy, że morfanty pkd2 będą naśladować zakrzywienie grzbietowej osi ciała występujące u mutantów pkd2 u danio pręgowanego i wykażą obecność cyst nerkowych mniej więcej w 2 - 3 dpf4.
Rycina 1: Reprezentatywne wyniki mikroiniekcji mRNA EGFP oraz morfolino AUG pkd2. (a) Zarodki TAB poddano mikroiniekcji w stadium 1 komórki z 0.17 ng mRNA EGFP i wizualizowano w 1 dpf w celu oceny ekspresji GFP in vivo. (b,c) Zarodki TAB poddano mikroiniekcji w stadium 1 komórki z ~1.7 nl morfolino blokującego translację pkd2 o stężeniu 0.50 mM i oceniono pod kątem zakrzywienia ciała w części grzbietowej w 4 dpf.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mikroiniekcja do zarodków danio pręgowanego jest uznaną i niezawodną techniką służącą do badania roli konkretnego genu w rozwoju. Zastosowania obejmują testy nadekspresji, błędnej ekspresji oraz wyciszania badanego genu, a także analizę epistatyczną między wieloma genami. Mikroiniekcja u danio pręgowanego jest szeroko stosowana do tworzenia zwierząt transgenicznych oraz mapowania losów komórek we wczesnych embrionach w stadium blastuli5,6,7,8,9. Ponadto zastosowanie tej techniki stanowi kluczowy etap w generow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez NIH oraz fundację PKD dla ZS. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Yale Animal Resources Center (YARC) oraz Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| 1x pożywka E3 | Odczynniki | 5 mM NaCl 0,17 mM KCl 0,33 mM CaCl22 0,33 mM MgSO42 0,1% błękitu metylenowego | ||
| Wszystkie pozostałe materiały zostały wymienione w protokole. |
Bibliografia
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon. (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
