Mikroiniekcja mRNA i oligonukleotydów antysensownych morfolino w zarodkach danio pręgowanego.

Podsumowanie

Mikroiniekcja to sprawdzona i skuteczna metoda wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych zarodków danio pręgowanego. W tym miejscu demonstrujemy solidną technikę mikroiniekcji do przeprowadzania badań nadekspresji mRNA i knockdownu genu oligonukleotydów morfoliinozydu u danio pręgowanego.

Streszczenie

Podstawowym narzędziem do badania roli genu podczas rozwoju jest możliwość przeprowadzenia badań nad knockdownem, nadekspresją i błędną ekspresją genu. U danio pręgowanego (Danio rerio) mikroiniekcja RNA, DNA, białek, oligonukleotydów antysensownych i innych małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka zapewnia naukowcom szybki i solidny test do badania funkcji genów in vivo. W tym artykule wideo pokażemy, jak przygotować i mikrowstrzyknąć in vitro syntetyzowane mRNA EGFP i blokujący translację morfoligo przeciwko pkd2, genowi związanemu z autosomalną dominującą wielotorbielowatością nerek (ADPKD), do zarodków zebry zebry w stadium 1-komórkowym. Następnie przeanalizujemy sukces mikroiniekcji mRNA i morfolino, weryfikując ekspresję GFP i analizę fenotypu. Szerokie zastosowania tej techniki obejmują generowanie zwierząt transgenicznych i chimer linii zarodkowej, mapowanie losów komórek i badania przesiewowe genów. W niniejszym artykule opisano protokół nadekspresji EGFP i knockdown pkd2 przez wstrzyknięcie mRNA i oligonukleotydu morfolinooligonukleotydowego.

Protokół

Część 1: Przygotowanie mikropipet i płytek komory mikroiniekcyjnej

1. Wytwarzanie mikropipet poprzez podgrzewanie i ciągnięcie kapilarnych probówek ze szkła borokrzemianowego (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) w urządzeniu do ściągania mikropipet (Sutter Instruments Inc., Flaming/Brown P-97). Przechowywać na szalce Petriego na niewielkiej ilości gliny lub taśmy klejącej.
2. Wlej 1,5% agarozy (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) do 1x pożywki E3 uformowanej z klinowatymi korytkami, które posłużą jako łatwa metoda trzymania zarodków podczas wstrzyknięcia (zgodnie z opisem w "The Zebrafish Book") ¹. Pozwól, aby płytki komory agarowej zestalały się przed użyciem i przechowuj w temperaturze 4ºC.

Część 2: Przygotowanie RNA

Jednym z potężnych podejść do badań nad funkcją genów jest mikroiniekcja in vitro transkrybowanego ograniczonego RNA do embrionów danio pręgowanego. Pokryty RNA zachowuje się podobnie do eukariotycznych mRNA znalezionych in vivo ze względu na obecność analogu CAP. Naukowcy zajmujący się danio pręgowanym rutynowo wykorzystują tę metodę do nadekspresji lub błędnej ekspresji interesującego ich genu. W tej demonstracji dokonamy mikroiniekcji transkryptu oznaczonego EGFP i użyjemy żywej ekspresji GFP z całego zarodka jako widocznego odczytu dla udanego wstrzyknięcia.

1. Przeprowadź reakcję transkrypcji RNA CAP in vitro na interesującym Cię transkryptze. W naszym laboratorium rutynowo wprowadzamy interesujące nas cDNA do wektora pCS2+ i przeprowadzamy reakcję syntezy in vitro dużych ilości ograniczonego RNA przy użyciu zestawu mMessage mMachine SP6 (Ambion, Inc., AM1340).
2. Oczyść próbkę RNA, przepuszczając ją przez zestaw RNeasy Mini (Qiagen, Inc., 74104) lub przez ekstrakcję fenol:chloroform i wytrącanie izopropanolu.
3. Dokładnie określ stężenie preparatu RNA i przechowuj w temperaturze -80ºC do momentu użycia.
4. W dniu wstrzyknięcia rozmrozić próbkę RNA, lekko zwirować i krótko odwirować.
5. Przygotować roztwór roboczy ze sterylną wodą i końcowym stężeniem 0,025 - 0,050% czerwieni fenolowej (Sigma-Aldrich Co., P0290). Czerwień fenolowa służy jako widoczny marker do wstrzykiwania roztworu do zarodka. W tym artykule przygotujemy roztwór roboczy 100 ng/uL mRNA EGFP z 0,050% czerwieni fenolowej.
6. Kontynuuj pracę próbki na lodzie i przywróć zapas RNA do -80°C.
7. Przejdź do części 4, gdy będziesz gotowy do wstrzyknięcia tej próbki.

Część 3: Przygotowanie morfolina

Antysensowne oligonukleotydy Morpholino są powszechnie używane do modyfikowania ekspresji genów poprzez blokowanie translacji docelowego białka lub modyfikację splicingu pre-mRNA ^2,3. Morfolinosy u danio pręgowanego służą jako potężne narzędzie genetyki odwrotnej poprzez osłabienie funkcji genów. W tym artykule będziemy mikrowstrzykiwać oligo morfolino ukierunkowany do miejsca inicjacji translacji pkd2 (5′-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3′). Opierając się na wcześniej ustalonej pracy, spodziewamy się, że wstrzyknięte zarodki będą fenotypowo naśladować zmutowaną rybę pkd2 ⁴.

1. Rutynowo zamawiamy 300 nmol oligo morfolino zaprojektowanego specjalnie dla interesującego nas genu w Gene Tools, LLC (Philomath, OR).
2. Dodać 100 μl sterylnej wody, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 3 mM. Roztwór należy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20°C do momentu przygotowania do użycia.
3. W dniu wstrzyknięcia należy podgrzewać roztwór morfoliny w temperaturze 65°C przez 5 minut. Natychmiast ostudzić na lodzie i krótko zakręcić. Ten etap denaturuje wszelkie struktury drugorzędowe w oligonugolakugi i zapewnia, że roztwór jest całkowicie rozpuszczony.
4. Przygotować roztwór roboczy, rozcieńczając roztwór morfolino w sterylnej wodzie i uzyskać końcowe stężenie 0,025 - 0,050% czerwieni fenolowej. W tej demonstracji przygotujemy roztwór roboczy 0,50 mM pkd2 morpholino z 0,050% czerwieni fenolowej.
5. Utrzymuj roztwór roboczy w temperaturze pokojowej.
6. Przejdź do części 4, gdy będziesz gotowy do wstrzyknięcia tej próbki.----

Część 4: Napełnianie mikropipety roztworem roboczym

1. Odetnij dystalną końcówkę mikropipety za pomocą kleszczyków lub chirurgicznej żyletki, aby utworzyć otwór, który jest widoczny tylko pod mikroskopem preparacyjnym (Nikon Instruments, Inc., SM2645) przy 50-krotnym powiększeniu.
2. Umieść 2 μl roztworu roboczego w postaci kropli na szkiełku nakrywkowym.
3. Przymocuj tylną część mikropipety do strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w rurkę umieszczoną na igle podskórnej i lekko zanurz dystalną końcówkę mikropipety w kropli roztworu roboczego. Należy uważać, aby nie ułamać końcówki mikropipety.
4. Zasysać roztwór roboczy przez dystalny koniec mikropipety, pociągając za tłok strzykawki.

Część 5: Kalibracja objętości iniekcji mikropipety

1. Umieść kroplę oleju mineralnego (American Bioanalytical, Inc., AB00921-00025) na szkiełku mikrometrycznym (Fisher, 12-561-SM1).
2. Włącz zasilanie i dopływ powietrza do aparatu mikrowtryskiwacza z impulsami ciśnieniowymi (World Precision Instruments Inc., PV830).
3. Przymocuj mikropipetę do uchwytu mikropipety w aparacie do mikroiniekcji. Mikrowtryskiwacz jest regulowany ciśnieniem, a wyładowania są aktywowane przez naciśnięcie pedału nożnego.
4. Pod mikroskopem preparacyjnym przetestuj objętość wtrysku za pomocą mikrowtryskiwacza, aby umieścić kroplę roztworu roboczego na oleju mikrometrycznym. Zmierz średnicę kropli, gdy unosi się ona jako kula na wierzchu oleju.
5. Dostosuj czas trwania wstrzyknięcia i ciśnienie wstrzyknięcia, aby dokładnie skalibrować objętość wstrzyknięcia. Ten krok pomaga w odtwarzalności eksperymentu z mikroiniekcją. W tej demonstracji wszystkie mikroiniekcje zostaną wykonane przy średnicy kropli 0,15 mm (około 1,76 nl objętości).
6. Po skalibrowaniu objętości wstrzykniętej wstrzykiwacza należy użyć pokrętła "Hold" na mikrowstrzykiwaczu, aby zapobiec zapełnieniu i wyciekowi z mikropipety.

Część 6: Przygotowanie zapłodnionych zarodków danio pręgowanego do mikroiniekcji

1. Danio pręgowany losowo łączy się w pary w ciągu pierwszych kilku godzin każdego ranka. Zbierz zarodki w stadium 1-komórkowym i umieść je w pożywce 1x E3.
2. Za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml (Becton Dickinson Labware, 357524) ułóż zarodki wzdłuż koryt w kształcie klina w płytkach komory do mikroiniekcji.
3. Usuń podłoże, aby zarodki były płytko zanurzone i nie zostały zalane. Ten etap pomaga w umieszczeniu zarodków na dnie koryt, a także w penetracji kosmówki przez mikropipetę.

Część 7: Mikroiniekcja przez kosmówkę

1. Manipuluj zarodkami za pomocą mikropipety tak, aby cytoplazma zarodka w stadium 1-komórkowym była widoczna pod mikroskopem preparacyjnym. Należy uważać, aby nie ułamać końcówki mikropipety.
2. Przeniknąć mikropipetą do kosmówki, a następnie do żółtka w celu wstrzyknięcia do zarodka. W tej demonstracji najpierw dokonamy mikroiniekcji do żółtka bezpośrednio pod komórką i pozwolimy, aby przepływ cytoplazmatyczny i dyfuzja wprowadziły roztwór roboczy do komórki. Przepływ ten jest widoczny dzięki czerwieni fenolowej dodanej do roztworu roboczego.
3. Zademonstrujemy również bezpośrednią iniekcję do cytoplazmy komórki. Bezpośrednia mikroiniekcja do komórki jest bardziej niebezpieczna, ale czasochłonna, ponieważ wymagana jest odpowiednia orientacja zarodka i technika mikroiniekcji. Ponieważ błona komórkowa jest bardziej rygorystyczna niż błona żółtka, często szybciej jest wprowadzić się do mikropipety przez żółtko, aby dotrzeć do cytoplazmy komórki. Ustawienie słupa dla zwierząt w kierunku dna koryta i praca pewnymi rękami może pomóc w tej metodzie wstrzykiwania.
4. Po mikroiniekcji umieścić zarodki na szalce Petriego z pożywką E3 i inkubować je w temperaturze 28,5°C w celu prawidłowego rozwoju.
5. Przez kilka następnych godzin i dni rozwoju zarodka obserwuj zarodki pod kątem interesujących Cię fenotypów.

Część 8: Reprezentatywne wyniki

Nadekspresja mRNA EGFP: Aby zweryfikować powodzenie mikroiniekcji, będziemy monitorować ekspresję GFP w rozwijających się zarodkach, począwszy od etapu tarczy (~6 hpf) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całego zarodka in vivo (Leica Microsystems GmBh, MZFLIII). Ekspresja konstruktu jest najsilniejsza we wczesnych fazach rozwoju embrionalnego i często zmniejsza się podczas rozwoju, ponieważ wstrzyknięty RNA z czapeczką ulega stopniowej degradacji i zależy od stabilności wyrażonego białka.

pkd2 morpholino blokujące translację: Na podstawie wcześniej opublikowanych wyników, spodziewamy się, że morfanty pkd2 będą naśladować krzywiznę osi grzbietowej ciała występującą u zmutowanego pkd2 danio pręgowanego i prezentować torbiele nerek na poziomie około 2 - 3 dpf⁴.

Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki mikroiniekcji mRNA EGFP i morfolino pkd2 AUG. (a) Zarodki TAB mikrowstrzykiwano w stadium 1-komórkowym z 0,17 ng mRNA EGFP i wizualizowano przy 1 dpf w celu ekspresji GFP in vivo. lit. b), c) Zarodki TAB mikrowstrzykiwano w stadium 1-komórkowym z ~1,7 nl morfolina blokującego translację pkd2 przy 0,50 mM i oceniano krzywiznę grzbietu ciała przy 4 dpf.

Dyskusja

Mikroiniekcja do zarodków danio pręgowanego jest dobrze ugruntowaną i solidną techniką badania roli określonego genu w rozwoju. Zastosowania obejmują testy nadekspresji, błędnej ekspresji i knockdown genu będącego przedmiotem zainteresowania, a także analizę epistatyczną między wieloma genami. Mikroiniekcja u danio pręgowanego jest szeroko stosowana do generowania zwierząt transgenicznych i mapowania losu komórek we wczesnych zarodkach blastuli^5,6,7,8,9. Ponadto zastosowanie tej techniki służy jako kluczowy kr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x E3 Medium	Reagent			5 mM NaCl 0,17 mM KCl 0,33 mM CaCl2 0,33 mM MgSO2 0,1% Błękit
Wszystkie inne materiały są wymienione w protokole.