Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Podsumowanie

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób morpholino lub mRNA można wstrzyknąć do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki, aby obniżyć lub zwiększyć poziom produktów konkretnych genów podczas dalszego rozwoju.

Streszczenie

Jedną z zalet badania danio pręgowanego jest łatwość i szybkość manipulowania poziomami białek w embrionie. Morfolina, będąca syntetycznym oligonukleotydem o komplementarności antysensownej do docelowych RNA, może zostać wprowadzona do embrionu w celu obniżenia ekspresji konkretnego produktu genu. Z kolei do embrionu można dodać przetworzone mRNA, aby zwiększyć poziom produktu genu. Metodą wprowadzania mRNA lub morfoliny do embrionu jest mikroiniekcja. Mikroiniekcja jest wydajna i szybka, co pozwala na iniekcję setek embrionów na godzinę. W niniejszym filmie przedstawiono wszystkie etapy mikroiniekcji. W skrócie: jaja są zbierane natychmiast po złożeniu i ustawiane w rzędzie przy szkiełku przedmiotowym w szalce Petriego. Następnie cienka igła wypełniona materiałem do iniekcji jest podłączana do mikroiniektora oraz źródła powietrza, a ustawienia mikroiniektora są regulowane w celu uzyskania pożądanej objętości iniekcji. Na koniec igła jest wprowadzana do żółtka embrionu, a następnie wstrzykiwana jest morfolina lub mRNA.

Protokół

Część 1: Produkcja i zbiór jaj

1. W noc poprzedzającą iniekcję umieść ryby w zbiornikach hodowlanych z zainstalowanymi przegrodami. Aby zwiększyć całkowitą produkcję ikry, ryby można ustawić w stosunku dwóch samic na jednego samca, jeśli jest to pożądane.
2. Następnego ranka, po zapaleniu świateł w pomieszczeniu, wyjmij przegrody z kilku zbiorników i pozwól na około 20 minut niezakłóconego kopulowania.
3. Za pomocą sitka zbierz ikrę z klatek hodowlanych i wypłucz ją wodą do ikry. Przelej ikrę do szalki Petriego z wodą do ikry i usuń niezapłodnione jaja oraz zanieczyszczenia za pomocą pipety transferowej. Ryby można ponownie pogrupować w większych zbiornikach, aby uzyskać kolejne porcje ikry do iniekcji. Dostosuj czas zbioru ikry tak, aby uzyskać maksymalną liczbę jaj, nie dopuszczając jednak do przejścia stadium jednej komórki.
4. Umieść szkiełko przedmiotowe w odwróconej pokrywie szalki Petriego o średnicy 100mm. Za pomocą pipety transferowej ustaw jaja wzdłuż krawędzi szkiełka, tworząc jedną kolumnę. Usuń nadmiar wody do ikry ze szkiełka, dociskając chusteczkę Kimwipe do strony przeciwległej do jaj. (Rysunek 1A)

Część 2: Wyciąganie, ładowanie i przygotowanie igły

1. Za pomocą wyciągarki do mikropipet wyciągnij kapilarę szklaną o średnicy zewnętrznej 1,0 mm w dwie igły i przechowuj je w szalce Petriego o średnicy 150 mm, kładąc na rampach z masy plastycznej (silly putty). Igły można wyciągnąć z wyprzedzeniem.
2. Napełnij igłę od tyłu 3 μL materiału do iniekcji, używając pipety do mikrodoładowywania (microloader). Potrząsaj bolusem w kierunku końcówki igły, aż pozostanie mało lub żadnych pęcherzyków powietrza.
3. Włącz źródło sprężonego powietrza i mikroinjektor. Włóż igłę do mikroinjektora i upewnij się, że jest szczelnie osadzona w obudowie. Sprawdź, czy mikromanipulator znajduje się w odpowiedniej pozycji, aby umożliwić szeroki zakres ruchu i regulacji. Przesuń końcówkę igły w pole widzenia mikroskopu, wysoko nad stolikiem, i ustaw ostrość na najcieńszym odcinku końcówki. Używając ostrych pęset, odetnij igłę w miejscu, które pozostawi ją wystarczająco wąską, aby przebić chorion i żółtko, ale wciąż zdolną do dostarczania kropli o stałej wielkości. Do obliczenia objętości każdej iniekcji można wykorzystać kroplę oleju mineralnego na mikrometrze. W przypadku iniekcji do oleju, kropla o średnicy 0,1 mm zawiera 500 pL materiału do iniekcji (rycina 1B); zazwyczaj stosuje się objętości iniekcji rzędu 500 pL lub 1 nL. Naciskaj pedał nożny i monitoruj wielkość kropli, przycinając igłę i dostosowując ciśnienie wstrzykiwania w razie potrzeby. Idealne objętości iniekcji powinny wypełniać około 10% objętości jaja. Jakość końcówki igły ma kluczowe znaczenie zarówno dla łatwości iniekcji, jak i dla jakości oraz powtarzalności wyników.

Część 3: Iniekcja

1. Upewnij się, że embriony nie rozwinęły się poza stadium czterech komórek. Idealnie, gdy embriony znajdują się w stadium jednej komórki.
2. Opuść igłę w stronę kolumny jaj, przytrzymując naczynie drugą ręką.
3. Przebij powierzchnię chorionu i wprowadź igłę do żółtka jednym płynnym ruchem, obserwując, czy nie dochodzi do zmiażdżenia lub rozerwania pęcherzyka żółtkowego. Wstrzyknij materiał do żółtka (rycina 1C). Unikaj wstrzykiwania pęcherzyków powietrza lub rozciągania żółtka, ponieważ oba te czynniki mogą być śmiertelne dla embrionu. Postępując wzdłuż linii, dostosuj ciśnienie w razie potrzeby, aby utrzymać stałą wielkość kropli, a za pomocą końcówki pipety usuń jaja, które wyglądają na niezapłodnione lub zostały zniszczone podczas procesu wstrzykiwania.
4. Po zakończeniu obróbki kolumny jaj, użyj delikatnego strumienia wody z jaj, aby przenieść wstrzyknięte jaja do czystej szalki Petriego. Powtórz w razie potrzeby. Zachowaj kilka niewstrzykniętych embrionów jako kontrolę. Pod koniec pierwszego dnia usuń martwe embriony i zapisz liczbę wstrzykniętych embrionów. Okresowo wymieniaj wodę z jaj w naczyniu, aby zmniejszyć ryzyko infekcji.

Część 4: Reprezentatywne wyniki

W zależności od tego, co jest wstrzykiwane, zarodki mogą wykazywać niższą przeżywalność niż ich niepoddane iniekcji rodzeństwo. Na szczęście możliwe jest łatwe wstrzyknięcie ogromnej liczby zarodków, więc rzadko stanowi to problem. Naturalne jest, że morfanty wykazują nieco opóźniony rozwój.

Aby zilustrować wyniki mikroiniekcji, zastosowaliśmy ten protokół do manipulacji poziomami białka Heart of Glass (Heg). Heg jest białkiem transbłonowym niezbędnym do prawidłowego rozwoju serca. W przypadku jego braku zarodki rozwijają serca z olbrzymimi drogami dopływowymi i komorami¹. Wstrzyknięto dwa wcześniej nieopisane morfolino przeciwko heg, heg_e3i3_egfr1 oraz heg_e4i4_egfr2, w stężeniu 500 μM. W 2. dniu po zapłodnieniu nieiniekcyjne rodzeństwo kontrolne wygląda prawidłowo, zgodnie z oczekiwaniami (rycina 2A i B). Zarodki wstrzyknięte z heg_e3i3_egfr1 wykazują obrzęk mózgu (rycina 2C). Chociaż serca większości tych morfantów mają zmienioną morfologię, ich komory mają prawidłową wielkość (rycina 2D). Zarodki wstrzyknięte z heg_e4i4_egfr2 wykazują zmienne wady serca. Niektóre wyglądają prawidłowo, podczas gdy inne mają duże drogi dopływowe i umiarkowanie powiększone przedsionki (rycina 2E i F). Mutant heg, jak zgłoszono wcześniej¹, posiada ogromnie powiększoną drogę dopływową i przedsionek (rycina 2G i H).

Wstrzykiwaliśmy również zarodki typu dzikiego z mRNA o stężeniu 400 ng/μL, przetranskrybowanym z pełnowymiarowego cDNA heg. Podczas gdy kontrole niewstrzyknięte rozwijają się prawidłowo (rycina 3A i B), zarodki wstrzyknięte z mRNA heg wykazują spektrum fenotypów, od wyglądu typu dzikiego po ciężką cyklopię, skrócenie głównej osi ciała, nekrozę głowy i ciała oraz wady linii pośrodkowej (rycina 3C i D).

Rysunek 1.  Embriony przeznaczone do iniekcji są ustawione wzdłuż szkiełka przedmiotowego w szalce Petriego (A).  Objętość iniekcji określa się poprzez wstrzyknięcie do oleju mineralnego umieszczonego na mikrometrze.  Objętość iniekcji 500 pL, powszechnie stosowana, ma średnicę 0,1 mm (B).  Bezpośrednio po iniekcji morpholino lub mRNA jest widoczne jako punktowa plamka w żółtku (C).

Rysunek 2.  W 2. dniu po zapłodnieniu embriony niepoddane wstrzyknięciu nie wykazują żadnych widocznych wad (A) ani fenotypu serca (B).  Embriony po wstrzyknięciu morpholino heg_e3i3_egfr1 wykazują obrzęk mózgu (C, strzałka), ale komory serca mają prawidłowe rozmiary (D).  Niektóre embriony po wstrzyknięciu morpholino heg_e4i4_egfr2 mają powiększone drogi dopływowe i przedsionki (E,F).  Mutanty heg mają silnie powiększone drogi dopływowe i przedsionki (G,H).  (A), (C), (E) i (G) to obrazy DIC 4x; (B), (D), (F) i (H) to obrazy DIC 20x. a=przedsionek, i t=droga dopływowa.

Rycina 3. W 24. godzinie po zapłodnieniu nieiniekcyjne embriony mają długie, proste ciało bez oznak martwicy lub wad linii środkowej (A) oraz dwa wyraźnie zarysowane oczy z rurką neuralną pomiędzy nimi (B). W przeciwieństwie do nich, niektóre embriony po iniekcji mRNA heg wykazują skrócenie osi ciała, martwicę, zniekształcone somity (C) oraz cyklopię (D). Zdjęcia (A) i (C) wykonano przy 4-krotnym powiększeniu w technice DIC; zdjęcia (B) i (D) wykonano przy 20-krotnym powiększeniu w technice DIC.

Dyskusja

Jedną z zalet modelu danio przebrany jest łatwość, z jaką można wprowadzić do zarodka lub usunąć z niego specyficzne produkty genów za pomocą mikroiniekcji. Aby dokonać powszechnej nadekspresji konkretnego białka, wstrzykuje się kodujące je mRNA do żółtka w stadium 1 komórki. W trakcie późniejszego rozwoju zarodka RNA rozprzestrzenia się w całym organizmie i podlega translacji. I odwrotnie, w celu wyeliminowania konkretnego białka stosuje się morfolino. Morfolino to syntetyczne oligonukleotydy zaprojektowane z komplementarności antysensownej do specyficznych RNA. Podobnie jak mRNA, morfolino są wstrzykiwane do żółtka w stadium 1 komórki. Wewnątrz zarodka wiążą one swoje docelowe RNA, zapobiegając translacji.

Główną modyfikacją, jaką należy wprowadzić dla każdego morpholino lub mRNA, jest stężenie wstrzykiwanego materiału. Zbyt wysokie stężenie morpholino lub mRNA może spowodować niespecyficzną toksyczność; choć każde morpholino musi zostać przetestowane empirycznie w celu określenia jego optymalnego stężenia, zazwyczaj stężenia morpholino między 200 μM a 500 μM skutecznie obniżają aktywność genu, nie powodując niespecyficznych wad. Precyzyjna wielkość otworu igły nie jest kluczowa. W określonym zakresie rozmiarów igieł można dostosować ciśnienie i czas wstrzykiwania, aby uzyskać bolus o odpowiedniej objętości.

Morfolino mają wiele zastosowań, w tym funkcjonalną analizę domen wewnątrz białka. Gdy są zaprojektowane tak, aby celować w konkretne złącza ekson-intron, morfolino zapobiegają zachodzeniu tam splicingu. Zbadaliśmy efekty działania dwóch morfolino wiążących złącza ekson-intron w pre-mRNA heg. Morfolino heg_e3i3_egfr1 wiąże złącze między eksonem 3 a intronem 3, uniemożliwiając maszynerii splicingu włączenie eksonu 3 do dojrzałych transkryptów. Morfolino heg_e4i4_egfr2 w podobny sposób usuwa ekson 4. Zarówno ekson 3, jak i 4 kodują domeny zawierające powtórzenia typu EGF. Niektóre embriony wstrzyknięte heg_e4i4_egfr2 wykazują umiarkowane fenokopiowanie mutanta; do zrozumienia roli eksonu 4 genu Heg w rozwoju serca będą wymagane dalsze eksperymenty. Co zaskakujące, embriony wstrzyknięte heg_e3i3_egfr1 wykazują obrzęk mózgu, cechę niewystępującą u mutantów heg. Może to wynikać ze zdolności morfolino do wiązania transkryptów macierzystych, które nie byłyby dotknięte w mutantach zygotycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikrowstrzykiwacz	Narzędzie	Harvard Apparatus	PLI 100
Mikromanipulator	Narzędzie	Narishige International	MN 153
Wytciągacz mikroelektrod	Narzędzie	Sutter Instrument Co.	P 97
Kapilary szklane	Narzędzie	World Precision Instruments, Inc.	TW100 F6
Pipety do napełniania mikroelektrod	Narzędzie	Eppendorf	5242956.003
Uchwyt do igieł	Narzędzie	World Precision Instruments, Inc.	MPH310