Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Podsumowanie

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Streszczenie

Leczenie cukrzycy typu 1 jest obciążeniem zarówno dla jednostki, jak i społeczeństwa, generując koszty przekraczające 100 miliardów dolarów rocznie. Pomimo powszechnego stosowania monitorowania glikemii i nowych formulacji insuliny, u wielu osób nadal rozwijają się wyniszczające powikłania wtórne. Transplantacja wysepek trzustkowych może przywrócić niemal normalną kontrolę poziomu glukozy u pacjentów z cukrzycą¹, bez ryzyka wystąpienia ciężkich epizodów hipoglikemii związanych z intensywną insulinoterapią. Zapewnienie wystarczającej masy wysepek jest kluczowe dla powodzenia transplantacji wysepek. Jednakże charakterystyka dawcy, sposób pozyskania oraz konserwacja narządu wpływają na wynik izolacji²Na University of Illinois at Chicago (UIC) opracowaliśmy skuteczny protokół izolacji z ulepszonym gradientem oczyszczania³Program rozpoczął się w styczniu 2004 roku i do listopada 2008 roku przeprowadzono ponad 300 izolacji. Trzustki przesyłano w chłodnych roztworach konserwujących (UW, University of Wisconsin lub HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate)^4-7do Laboratorium Izolacji Komórek w UIC w celu izolacji wysepek. Wysepki trzustkowe zostały wyizolowane metodą UIC, która jest zmodyfikowaną wersją metody pierwotnie opisanej przez Ricordiegoi wsp. ⁸. W skrócie, po oczyszczeniu trzustki z otaczających tkanek, przeprowadzono perfuzję roztworem enzymatycznym (Kolagenaza Serva + Proteaza Neutralna lub enzym Sigma V). Następnie obrzękłą trzustkę przeniesiono do komory trawiennej Ricordi, podłączono do zmodyfikowanego, zamkniętego systemu rurek cyrkulacyjnych i ogrzano do 37°C. Podczas trawienia komorę delikatnie wstrząsano. W celu monitorowania postępu trawienia pobierano próbki w sposób ciągły. Po wykryciu wolnych wysepek pod mikroskopem, proces trawienia zatrzymano poprzez wprowadzenie do systemu cyrkulacyjnego zimnego (4°C) roztworu rozcieńczającego RPMI (Mediatech, Herndon, VA) w celu rozcieńczenia enzymu. Po zebraniu i przemyciu w medium M199 uzupełnionym ludzką albuminą, pobrano próbkę tkanki do obliczenia liczby komórek przed oczyszczaniem, a następnie inkubowano ją w roztworze UW przed procesem oczyszczania. Proces oczyszczania zostanie opisany w Części II: Oczyszczanie i hodowla ludzkich wysepek.

Protokół

1. Przygotowanie zaplecza

1. Izolacja wysepek trzustkowych człowieka jest procedurą wrażliwą na czas, która wymaga pracy zespołowej, dlatego do jej przeprowadzenia potrzebne są cztery osoby. Zespołem kieruje chirurg, który dokonuje wycięcia i kanulacji trzustki.
2. Izolacja wysepek rozpoczyna się w momencie wejścia zespołu do laboratorium izolacji wysepek UIC. Członkowie zespołu upewniają się, że cała niezbędna aparatura, taka jak wirówka, została sprawdzona i włączona. Dbają również o dezynfekcję wszystkich dygestoriów i powierzchni.
3. Dwie osoby przygotowują stół do kanulacji, maszynę do chłodzenia (slush machine), układ trawienia, jednostkę perfuzyjną, maszynę do oczyszczania COBE oraz stoły chirurgiczne.
4. Jednocześnie dwóch pozostałych członków zespołu przygotowuje pożywki niezbędne podczas izolacji.
5. Następnie przygotowywane są probówki bakteriologiczne (butelki, probówki, formularz i worek), probówki do pobierania próbek (wypełnione wcześniej roztworem płuczącym) oraz probówki i płytki do oceny.
6. Zestaw probówek do oczyszczania należy przygotować w następujący sposób: pierwsza probówka pozostaje pusta i jest zaznaczona do poziomu 150 ml, probówki od 2 do 12 są wypełnione 200 ml pożywki M199 uzupełnionej o albuminę ludzką (roztwór płuczący) i zaznaczone do poziomu 230 ml, a na koniec jedna probówka stożkowa 50 ml jest wypełniona 50 ml roztworu płuczącego. Po zakończeniu tych etapów przygotowawczych można przystąpić do przygotowania i perfuzji trzustki.

2. Przygotowanie i perfuzja trzustki

1. Aby rozpocząć przygotowanie i perfuzję trzustki, operator wyjmuje organ z opakowania, stosując technikę sterylną. Następnie chirurg przenosi trzustkę na stół do dekontaminacji.
2. Chirurg napełnia jedną strzykawkę o pojemności 60 ml oryginalnym roztworem do konserwacji trzustki i przekazuje ją operatorowi, który wykorzystuje go do napełnienia przygotowanych butelek bakteriologicznych do „pobrania” (Procurement).
3. Po inspekcji wizualnej w celu ustalenia, czy organ nadaje się do izolacji wysepek (jeśli trzustka została uszkodzona podczas pobrania lub wykazuje nieprawidłowości anatomiczne, nie może być użyta do izolacji wysepek), chirurg prosi operatora o przygotowanie kolagenazy. Należy pamiętać, że czas resuspensji różni się w zależności od marki i serii enzymu.
4. Gdy chirurg będzie gotowy, należy dostarczyć roztwory do dekontaminacji (Betadine, Fungizone/Cefazolin oraz HBSS) na stół do dekontaminacji i przelać je do odpowiednich pojemników. Chirurg przeprowadza mycie dekontaminacyjne trzustki, płucząc ją przez minutę w każdym z roztworów do dekontaminacji. Następnie trzustkę umieszcza się w małym sterylnym słoiku, w którym zostaje zważona. Po wprowadzeniu wagi do dokumentacji partii (batch record), trzustkę umieszcza się w kuwecie do kaniulacji z niewielką ilością roztworu do konserwacji.
5. Chirurg odsłania i częściowo nacinaje główny przewód trzustkowy, a następnie kaniuluje każdą połowę trzustki za pomocą kaniuli. Kaniulę mocuje się szwem. Aby przeprowadzić perfuzję trzustki, należy najpierw przenieść ją do jednostki perfuzyjnej i wlać roztwór enzymu do zbiornika. Całkowity czas perfuzji wynosi około 10 minut: 5 minut przy ciśnieniu 80 mmHg, a następnie 5 minut przy 180 mmHg. Po perfuzji trzustka powinna być rozszerzona.
6. Perfundowaną trzustkę przenosi się do kuwety do kaniulacji, gdzie ostrożnie usuwa się tkankę tłuszczową. Następnie trzustkę tnie się na 10-12 kawałków i przenosi do komory Ricordiego w celu trawienia.

3. Trawienie trzustkowe

1. Aby rozpocząć etap trawienia, przenieś trzustkę do pustej komory Ricordi, dodaj jedną fiolkę 2,5 ml Pulmozyme, ułóż tkankę na sitku (unikając dużych fragmentów, które mogłyby zablokować komorę), zamknij komorę i napełnij system.
2. Uruchom pompowanie roztworu na 5 minut. Delikatnie kołysz komorą, aby równomiernie rozprowadzić ciepły roztwór. Po pięciu minutach delikatnie potrząsaj komorą przez całą fazę trawienia. Utrzymuj temperaturę na poziomie 37˚C.
3. Delikatnie kołysz komorą, aż temperatura osiągnie 37°, a następnie potrząsaj komorą. Pobieraj próbkę co dwie minuty i sprawdzaj pod mikroskopem, czy obecne są wolne wysepki. Zapisz informacje z oceny wysepek w tabeli trawienia w protokole serii. Kontynuuj monitorowanie odsetka wysepek, aż 50% z nich będzie swobodnie pływać i będzie wyizolowanych w roztworze.

4. Pobieranie tkanek

1. Gdy w próbkach stwierdzi się, że 50% wysepek jest wolnych, trawienie zostaje zatrzymane poprzez dodanie do obiegu zimnego roztworu rozcieńczającego RPMI. Tkankę zbiera się do probówek stożkowych o pojemności 500 ml, uprzednio wypełnionych 30 ml albuminy ludzkiej. Po odwirowaniu probówek odsysa się nadsącz i przemywa osad zimnym roztworem do mycia. Probówki stożkowe wiruje się przy 1100 RPM (obrotów na minutę) przez 1 minutę w temperaturze 4˚C.
2. Wszystkie probówki zbiorcze z zawiesiną strawionej tkanki trzustkowej łączy się w jednej probówce stożkowej o pojemności 500 ml. Gdy probówka wypełni się przemytą tkanką, wiruje się ją i powtarza proces mycia, aż cała tkanka zostanie przemyta kilkukrotnie. Następnie wiruje się tę probówkę i przenosi tkankę do jednej probówki stożkowej o pojemności 250 ml. Objętość uzupełnia się do 250 ml roztworem do mycia M199 uzupełnionym o HA i przygotowuje do pobrania próbek.
3. Za pomocą pipety pobiera się próbkę 1 ml i dodaje ją do probówki stożkowej o pojemności 15 ml, uprzednio wypełnionej 9 ml roztworu do mycia. Następnie miesza się zawartość, delikatnie odwracając probówkę stożkową 15 ml, a z niej pobiera się 1 ml bezpośrednio do komory licznikowej. Należy policzyć komórki i obliczyć ich liczbę, stosując czynnik rozcieńczenia 2500 (10x250).
4. Wirować probówkę stożkową 250 ml i dodać 150 ml roztworu UW (University of Wisconsin), który jest zazwyczaj stosowany do konserwacji organów. Po dodaniu UW należy dokładnie wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą pipety. Należy zapisać i przekazać operatorowi oczyszczania czas rozpoczęcia inkubacji w roztworze UW. Probówkę(i) pozostawia się na lodzie, okazjonalnie delikatnie nią potrząsając. Teraz wysepki mogą zostać poddane dalszemu oczyszczaniu.

Dyskusja

Na wynik izolacji wpływa szereg czynników 9,10. Wśród nich kluczową rolę odgrywa trawienie tkanki trzustki. W oparciu o nasze doświadczenie w izolacji ludzkich wysepek podsumowaliśmy następujące krytyczne punkty, które mogą potencjalnie wpływać na wydajność i jakość uzyskanych wysepek.

1. Czas trawienia różni się w zależności od rodzaju zastosowanych enzymów.
2. Gdy 40-50% wysepek zostanie całkowicie oddzielonych od tkanki zwojowej, trawienie należy natychmiast przerwać, dodając roztwór rozcieńczający i s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Maszyna do produkcji lodu kruszonego	wyposażenie	Firma Taylor	K4036546	przygotowanie sterylnego lodu
Wirówka	sprzęt	Beckman Coulter Inc.	424803
Mikroskop odwrócony MZ6 TLBD4.1	sprzęt	Leica Microsystems	4103
Szalka do hodowli komórek z siatką 2 mm	wyposażenie	Nalge Nunc international	174926	liczenie wysepek
Cyfrowa łaźnia wodna EX7	wyposażenie	NesLab	105361058
Termometr	wyposażenie	IBI:IR	60444
Waga MonoBloc Balance AB 104-S	wyposażenie	Mettler Toledo	1119430864	pomiar masy trzustki
Kontroler prędkości MasterFlex II	wyposażenie	Cole-Parmer	Pobieranie i izolacja RNA z tkanek roślinnych Abstrakt Izolacja wysokiej jakości całkowitego RNA jest kluczowym krokiem w wielu badaniach biologii molekularnej, w tym w analizie ekspresji genów za pomocą RT-qPCR (ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją) oraz sekwencjonowaniu RNA. Tkanki roślinne stanowią jednak szczególne wyzwanie ze względu na obecność wielkich ilości wielocukrów, polifenoli i innych wtórnych metabolitów, które mogą współwytrącać się z kwasami nukleinowymi i hamować późniejsze reakcje enzymatyczne. W niniejszym filmie przedstawiono zoptymalizowany protokół ekstrakcji RNA z tkanek roślinnych przy użyciu metody opartej na izotiocyjanianie guanidyny i bromku fenolu, która zapewnia wysoką czystość i integralność uzyskanego materiału genetycznego. Słowa kluczowe izolacja RNA, tkanki roślinne, RT-qPCR, analiza ekspresji genów, bromek fenolu, izotiocyjanian guanidyny, oczyszczanie kwasów nukleinowych	regulacja prędkości przepływu podczas trawienia
Cyfrowy celownik DS L1	wyposażenie	Nikon Instruments	217267
Jednostka perfuzyjna	wyposażenie	Wykonany na zamówienie	Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego, proszę o przesłanie materiałów do tłumaczenia. Jestem gotowy do przetłumaczenia treści naukowych JoVE z języka angielskiego na polski, zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego i precyzji terminologicznej.
Chłodnica do jednostki perfuzyjnej	wyposażenie	Fisher Scientific	3013P
Komora Ricordiego	sprzęt	University of Miami	Nie dotyczy
roztwór rozcieńczający RPMI	odczynnik	Mediatech, Inc.	99783024
roztwór University of Wisconsin (UW)	odczynnik	DURAMED	1000-46-06
Hank’zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)	odczynnik	Mediatech, Inc.	99-597-CM
25% albuminy ludzkiej	odczynnik	GRIFOLS	NDC 61953-0002-2
pożywka M199 (roztwór płuczący)	odczynnik	Mediatech, Inc.	99-784-CM
Kolagenaza NB1 klasy GMP	odczynnik	Elektroforeza SERVA	N0002937
Neutralna proteaza NB1 klasy GMP	odczynnik	Elektroforeza SERVA	N0002936
Betadine	odczynnik	Cardinal Health	29906-004
Cefazolina	odczynnik	West-Ward Pharmaceutical	NDC 0143-9924-90
Dytyzon	odczynnik	Sigma-Aldrich	D5130