Monitorowanie hormonów roślinnych podczas odpowiedzi na stres

Podsumowanie

Przedstawiono prostą metodę umożliwiającą szybką ekstrakcję i analizę wielu hormonów roślinnych z niewielkich próbek tkanek. Procedura wykorzystuje ekstrakcję w fazie gazowej jako jedyny etap oczyszczania. Próbki analizuje się za pomocą GC/MS z jonizacją chemiczną, która generuje głównie jony (M+1)+.

Streszczenie

Hormony roślinne i powiązane z nimi związki sygnałowe odgrywają istotną rolę w regulacji reakcji roślin na różnorodne bodźce i stresy środowiskowe. Do najpoważniejszych stresów należą żerowanie owadów, infekcje patogenami oraz stres suszy. W przypadku każdego z tych stresów znany jest konkretny zestaw hormonów i/lub ich kombinacji, które precyzyjnie dostrajają odpowiedzi organizmu, zapewniając tym samym przetrwanie rośliny. Głównymi hormonami zaangażowanymi w regulację tych reakcji są kwas jasmonowy (JA), kwas salicylowy (SA) oraz kwas abscysynowy (ABA). Aby lepiej zrozumieć rolę poszczególnych hormonów, a także ich potencjalne interakcje podczas tych odpowiedzi, konieczne jest monitorowanie zmian w ich zawartości zarówno w czasie, jak i w przestrzeni. W celu łatwego, czułego i powtarzalnego oznaczania ilościowego tych i innych związków sygnałowych opracowaliśmy metodę opartą na ekstrakcji w fazie gazowej i analizie za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas (GC/MS) (1, 2, 3, 4). Po ekstrakcji tych związków z tkanki roślinnej za pomocą kwaśnego wodnego 1-propanolu zmieszanego z dichlorometanem, związki zawierające kwasy karboksylowe są metylowane, odparowywane pod wpływem ciepła i zbierane na absorbencie polimerowym. Po elucji do fiolki z próbką anality są rozdzielane metodą chromatografii gazowej i wykrywane za pomocą spektrometrii mas z jonizacją chemiczną. Zastosowanie odpowiednich standardów wewnętrznych pozwala następnie na prostą kwantyfikację poprzez odniesienie powierzchni piku anality do powierzchni piku standardu wewnętrznego.

Protokół

1. W pierwszej kolejności należy przygotować fiolki z nakrętką o pojemności 2ml do ekstrakcji: do fiolki dodaje się 400ul buforu do ekstrakcji (1-propanol:H2O:stężony HCl 2:1:0,002 obj./obj./obj.) oraz 10 μl odpowiedniego standardu wewnętrznego (10ng/μl). Próbkę zamraża się w ciekłym azocie, a następnie dodaje kulki ceramiczne.
2. Materiał roślinny (od 50 do 200mg) dodaje się, gdy fiolki wciąż znajdują się w ciekłym azocie. Należy pamiętać, że masę dodanego materiału roślinnego należy oszacować przed dalszą obróbką, aby umożliwić późniejszą dokładną kwantyfikację opartą na masie świeżej.
3. Należy upewnić się, że cały ciekły azot odparował przed szczelnym zamknięciem fiolki nakrętką. Należy pamiętać, że nakrętka musi posiadać uszczelkę gumową, aby zapobiec wyciekom rozpuszczalników, a tym samym ekstrahowanych związków podczas homogenizacji.
4. Tkankę homogenizuje się w homogenizatorze kulkowym FastPrep lub Precellys przy prędkości 6000 (dla Precellys) przez 30 s.
5. Fiolki wyjmuje się z homogenizatora pojedynczo, ostrożnie otwiera nakrętki i do każdej próbki dodaje 1ml dichlorometanu. Fiolki ponownie szczelnie zamyka się i ponownie homogenizuje przez 10-15 s przy prędkości 6000 (Precellys).
6. Fiolki przenosi się do wirówki stołowej i oddziela fazę organiczną od fazy wodnej przy 10.000xg przez 60 s.
7. Po rozdzieleniu faz dolną zieloną warstwę (faza organiczna, zawiera hormony i standardy wewnętrzne) przenosi się z poszczególnych fiolek do czystej szklanej fiolki o pojemności 4ml. Należy unikać przenoszenia wody (faza górna). Alternatywnie, zamiast dichlorometanu można użyć octanu etylu. W takim przypadku faza octanu etylu będzie warstwą górną (zieloną), co ułatwi jej usunięcie i przeniesienie do nowej szklanej fiolki 4ml. Podobnie jak wcześniej, należy unikać przenoszenia wody.
8. Rozpuszczalnik odparowuje się strumieniem powietrza przez manifold przez około 10-25 min (zależnie od próbki); za pomocą pojedynczej końcówki doprowadzającej powietrze należy (ostrożnie) sprawdzić, czy próbki są suche. Nie należy nadmiernie wysuszać próbek, ponieważ może to spowodować straty związków.
9. Po wysuszeniu próbek można rozpocząć metylację związków zawierających kwasy karboksylowe. Najpierw do każdej fiolki dodaje się 100 μl mieszaniny dietylu eteru i metanolu (9:1 obj./obj.), a następnie 4μl 2M roztworu trimetylosililodiazometanu (w heksanie, Sigma Aldrich). Fiolki natychmiast zamyka się nakrętką z silikonową septą z wkładką teflonową. Próbkę delikatnie wstrząsa się i inkubuje w RT przez 25 do 30 min.
10. Po zakończeniu kroku 9 należy włączyć blok grzejny i ustawić pożądaną temperaturę zbierania. Lotność zmetylowanych związków zależy od ich wielkości, ale także od innych, bardziej polarnych grup, takich jak =O, -OH i -NH. Dla estrów metylowych kwasu jasmionowego i kwasu salicylowego wystarczająca jest temperatura zbierania około 80°C, podczas gdy inne związki, np. kwasy tłuszczowe C18, koniugaty kwasu jasmionowego z aminokwasami, koronatyna oraz ester metylowy kwasu 12-okso-fitodienoicznego, wymagają temperatury między 180 a 200°C do efektywnej lotnienia.
11. Po 30-minutowej inkubacji reakcję metylacji należy przerwać, aby uniknąć niepożądanych reakcji wtórnych. Odbywa się to poprzez dodanie 4 μl 2M roztworu kwasu octowego (w heksanie) do każdej fiolki. Po zamknięciu fiolek nakrętkami i krótkim mieszaniu w wortexie, próbki inkubuje się przez kolejne 30 min.
12. Filtry używane do tej ekstrakcji z fazy gazowej są wykonane ręcznie i w przedstawionej formie nie są dostępne komercyjnie. Składają się one z zewnętrznej rurki teflonowej (o długości około 7-8 cm), do której z jednej strony wsuwa się dopasowaną rurkę szklaną o długości około 4 cm. Z drugiej strony rurki teflonowej do wnętrza wsuwa się stalową siatkę, aż dotrze ona do wewnętrznej rurki szklanej, a na nią dodaje się około 20-30mg adsorbenta (SuperQ 80/100 (wycofany z produkcji) lub HayeSep® Q80/100). Wsuwa się kolejną stalową siatkę, a na koniec do rurki teflonowej wsuwa się końcówkę szklaną, ostrożnie dociskając stalową siatkę do adsorbenta. Szczegółowe zdjęcie filtra przedstawiono na rysunku 1.
    
    Rysunek 1.
13. Podczas czasu inkubacji z kroku 11 filtry do zbierania zmetylowanych, a tym samym lotnych hormonów roślinnych, należy przemyć najpierw 200ul metanolu, a następnie dwukrotnie 200ul dichlorometanu. Pozostały w filtrach rozpuszczalnik odparowuje się strumieniem powietrza. Filtry mogą być teraz użyte do wychwytywania lotnych hormonów poprzez ekstrakcję z fazy gazowej.
14. Po 30 minutach inkubacji septy gumowe nakrętek fiolek 4ml przecina się skalpelem. Aby zebrać hormony roślinne metodą ekstrakcji z fazy gazowej, oczyszczone filtry podłącza się do poszczególnych linii próżniowych przy przepływie około 800ml/min. Filtry wprowadza się następnie do fiolki przez przecięte septy. Wprowadza się również małą końcówkę pipety, która pełni rolę wlotu powietrza. Podczas tej początkowej części procedury fiolki z włożonymi filtrami muszą być trzymane w pozycji pionowej, aby żadna ciecz wewnątrz fiolki nie miała kontaktu z końcówką filtra, co zanieczyszczyłoby filtr, a w konsekwencji także układ GC/MS. Fiolki trzyma się ręcznie, aż cała ciecz odparuje przez filtr. Następnie fiolki z przymocowanymi filtrami umieszcza się na bloku grzejnym i zbiera odparowane termicznie związki przez 3 min. Główne komponenty systemu oraz konfiguracja przedstawione są na rysunku 1. Po tym końcowym etapie ekstrakcji z fazy gazowej fiolki z wciąż przymocowanymi filtrami umieszcza się na statywie i pozostawia do ostygnięcia.
15. Gdy filtry ponownie osiągną temperaturę pokojową, eluouje się je 150ml dichlorometanu do fiolki GC o pojemności 1,5 ml z wkładką. Po wydmuchaniu pozostałego rozpuszczalnika z filtra, fiolki zamyka się i analizuje za pomocą GC/MS.

Do analizy należy użyć chromatografu gazowego wyposażonego w injektor split/splitless (tryb splitless 250°C, objętość wtrysku 1μL) połączonego ze spektrometrem mas pracującym w trybie jonizacji chemicznej (CI). Związki są rozdzielane na kolumnie HP-1MS (30m x 0.25mm x 0.25μm) utrzymywanej w temperaturze 40°C przez 1min po wtrysku, a następnie temperatura jest programowana w tempie 15°C/min do 250°C (przez 10min), z helem jako gazem nośnym (stały przepływ 0.7ml/min). Do analizy opartej na MS można zastosować zarówno spektrometr mas z analizatorem kwadrupolowym (np. Agilent HP5973), jak i z pułapką jonową (np. Varian Saturn 2200). Jako gaz CI można wykorzystać izobutan (dostarczany w butlach) lub metanol (wykorzystuje się opary z rezerwuaru z cieczą), jednak w każdym przypadku należy sprawdzić fragmenty reakcji jonizacji przed utworzeniem programów zliczanego jonu wybranego (SIC). W systemie Varian GC 3900/Saturn MS 2200 z metanolem jako reagentem CI zastosowaliśmy następujący program: 5.00-11.30min jony (M+1)⁺ 153-158 (salicylan metylu 153, salicylan metylowy ²H₅); 11.30-13.30min jony (M+1)⁺ 207-228 (jasmonian metylu 207 i 225, dihydrojasmonian metylu 209 i 227); 13.30-16.30min jony (M+1)⁺ 237-300 (kwas abscisowy metylowy 261, kwas abscisowy metylowy ²H₆ 267 (kwas abscisowy generuje głównie jony [M-H₂O+1]⁺)). Wszystkie związki należy zidentyfikować poprzez porównanie z autentycznymi, dostępnymi komercyjnie wzorcami. Ilościowe oznaczenie JA, SA i ABA wykonuje się poprzez korelację pola powierzchni piku (jonów ekstrahowanych) z polem powierzchni piku (jonów ekstrahowanych) odpowiedniego standardu wewnętrznego, w odniesieniu do masy świeżej użytego materiału roślinnego.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda okazała się niezawodna dla szerokiego spektrum związków sygnałowych roślin, pod warunkiem, że wielkość i charakter chemiczny związku nie uniemożliwiają jego ekstrakcji, metylacji i odparowania. Ponadto opisana w niniejszym opracowaniu procedura metylacji nie jest jedynym sposobem derywatyzacji. Sylilacja i acetylacja stanowią alternatywne metody, których protokoły można łatwo znaleźć w sieci.

Jeśli spektrometr mas nie umożliwia monitorowania pojedynczych jonów, zakre...