Artykuł metodologiczny

Rodopsyna kanałowa2 Stymulacja potencjałów synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych Drosophila

DOI:

10.3791/1133

⸱

16 marca 2009

 ,  , 
1Department of Biology, Brandeis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura wykorzystuje aktywowany niebieskim światłem kanał glonów i narzędzia do ekspresji genetycznej specyficznej dla komórki, aby wywołać potencjały synaptyczne za pomocą impulsów świetlnych na złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) u larw Drosophila. Technika ta jest niedrogą i łatwą w użyciu alternatywą dla stymulacji elektrodami ssącymi w badaniach fizjologii synaptycznej w laboratoriach badawczych i dydaktycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Preparat nerwowo-mięśniowy larw Drosophila okazał się użytecznym narzędziem do badania fizjologii synaps1,2,3. Obecnie jedynym dostępnym sposobem na wywołanie wzbudzających potencjałów połączeniowych (EJP) w tym preparacie jest zastosowanie elektrod ssących. Zarówno w laboratoriach badawczych, jak i dydaktycznych studenci często mają trudności z manewrowaniem i manipulowaniem tego typu elektrodą stymulującą. W niniejszej pracy pokazujemy, jak zdalnie stymulować potencjały synaptyczne na larwie NMJ bez użycia elektrod ssących. Poprzez ekspresję rodopsyny kanałowej2 (ChR2) 4,5,6 w neuronach ruchowych Drosophila przy użyciu systemu GAL4-UAS 7 i wprowadzając niewielkie zmiany w podstawowym sprzęcie elektrofizjologicznym, byliśmy w stanie niezawodnie wywołać EJP za pomocą impulsów niebieskiego światła. Technika ta może być szczególnie przydatna w laboratoriach dydaktycznych neurofizjologii, w których czas i zasoby ćwiczeń studenckich są ograniczone.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Część 1: Opieka nad zwierzętami i krzyżówki genetyczne

  1. Linki muchowe UAS-ChR2 i OK371-GAL4 należy przechowywać w oddzielnych butelkach zawierających standardowe podłoża przeciwmuchowe 8.
  2. Zbieraj dziewice z linek muchowych OK371-GAL4 i samce z linii UAS-ChR2.
  3. Umieścić zarówno samce, jak i samice w fiolce zawierającej standardowe podłoże przeciw muchom zmieszane z 1 mM all-trans retinal (ATR). Pokarm ATR należy przygotować poprzez uprzednie stopienie zwykłych pożywek muchowych w kuchence mikrofalowej przez ~1 minutę. Po stopieniu pozostaw do ostygnięcia przez około 30 sekund do jednej minuty, a następnie dodaj 100 μl 100 mM ATR w 100% ETOH na każde 10 ml podłoża muchowego. Umieścić fiolki na lodzie, a następnie przechowywać w ciemnym miejscu w temperaturze 4°C.
  4. Pozwól muchom łączyć się w pary i składać jaja w ciemnym miejscu w temperaturze 22-25°C.
  5. Odczekaj 3-4 dni, aż pojawią się larwy w trzecim stadium rozwojowym; w tym momencie pozbądź się dorosłych much.

Część 2: Konfiguracja platformy

  1. Przymocuj dowolny okular lunety sekcyjnej 10x (w naszym przypadku firmy Carl Zeiss Inc., www.zeiss.com, Thornwood, NY) do niebieskiego źródła światła LED z radiatorem (Thor labs, www.thorlabs.com, Newton, NJ). Przymocuj do podstawy magnetycznej za pomocą słupka i zacisku. Przykryj radiator elektrycznie uziemioną osłoną, aby zmniejszyć szum elektryczny generowany przez źródło światła.
  2. Umieść podstawę magnetyczną ze źródłem światła na stole powietrznym urządzenia do elektrofizjologii.
  3. Podłącz źródło światła do obwodu sterującego i podłącz obwód sterujący do zewnętrznego źródła napięcia (Powerlab 4/30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).
  4. Daj impulsy 1-5 V do obwodu sterującego, aby aktywować niebieskie światło.
  5. Dostosuj podstawę magnetyczną i źródło światła, aż wiązka niebieskiego światła skupi się na obszarze, który ma być zajęty przez rozwarstwienie larwalne.

Część 3: Sekcja

  1. Umieść sześć 0,1 mm szpilek do owadów w podłodze naczynia wyłożonego sylgardem.
  2. Usuń larwy 3stopnia rozwojowego z podłoża spożywczego i umieść je na dowolnej plastikowej szalce Petriego.
  3. Opłucz larwy solą fizjologiczną, aby usunąć jedzenie.
  4. Umieść larwy w naczyniu preparacyjnym w pobliżu wyciągniętych szpilek i dodaj sól fizjologiczną do 1/2 poziomu.
  5. Ustaw larwy tak, aby można było zobaczyć dwie srebrzyste rurki (tchawicę) biegnące wzdłuż grzbietowej powierzchni zwierzęcia.
  6. Włóż dużą szpilkę bezpośrednio do ogona między rurkami dotchawiczy. Przytrzymaj larwy i umieść drugą dużą szpilkę w jego głowie, upewniając się, że rozciągniesz ciało wzdłuż.
  7. Wykonaj małe nacięcie w pobliżu ogona i kontynuuj je wzdłuż ciała. Upewnij się, że końcówki nożyczek są uniesione, aby przypadkowo nie przeciąć nerwów brzusznych i/lub mięśni ściany ciała.
  8. Umieść cztery szpilki w czterech rogach teraz otwartej części środkowej zwierzęcia. Umieść je w naczyniu sekcyjnym, aby zwierzę zostało wyfiletowane. Przygotowanie do szpilek jest nauczane.
  9. Za pomocą kleszczy i nożyczek usuń wnętrzności, tchawicę i ciała tłuszczowe zwierzęcia.
  10. Opłucz preparat solą fizjologiczną.
  11. Zlokalizuj płaty czołowe (jak pokazano na ryc. A) i zwój brzuszny preparatu.
  12. Za pomocą mikronożyczek ostrożnie przetnij zwój brzuszny tuż za płatami czołowymi.

Część 4: Rejestracja mięśni i stymulacja światłem niebieskim

  1. Wyciągnij elektrodę 10-20 μω za pomocą elektronicznego ściągacza elektrod (Sutter Instruments).
  2. Napełnij wyciągniętą elektrodę 3 M KCl.
  3. Umieść wypełnioną elektrodę w uchwycie elektrody i manewruj końcówką elektrody za pomocą mikromanipulatora w pobliżu preparatu larwalnego pod mikroskopem preparacyjnym na stanowisku do elektrofizjologii.
  4. Zidentyfikuj mięsień 6 (M6) w dowolnym segmencie ściany ciała (ryc. A).
  5. Ostrożnie włóż elektrodę do M6 i obserwuj, czy nie ma szybkiej hiperpolaryzacji. Potencjały błony spoczynkowej mięśni powinny wynosić od -30 mV do -70 mV.
  6. Dostosuj niebieskie światło tak, aby preparowany preparat był wyśrodkowany w wiązce światła.
  7. Daj impulsy napięciowe 20-100 ms do obwodu sterującego. Przyrostowo zwiększaj napięcie dostarczane do obwodu sterującego. Obserwuj potencjały połączeń pobudzających w komórce mięśniowej (ryc. 1B).

Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1A pokazuje schemat ustawienia zapisu i przygotowania filetowania. Rysunek 1B przedstawia typowy EJP wywoływany przez krótkie impulsy świetlne. Pokazana amplituda EJP jest zsumowaną amplitudą z dwóch neuronów ruchowych znanych z unerwienia M6. Niższe natężenie światła aktywowało tylko jedną jednostkę silnikową (dane nie pokazane).

figure-protocol-1

Rysunek 1: A) Ogólny schemat wewnątrzkomórkowego urządzenia rejestrującego z niebieską diodą LED. Mózg (Br) jest usuwany w celu zahamowania rytmicznej aktywności w zwoju brzusznym (VG). ChR2 ulega ekspresji w neuronach ruchowych za pomocą systemu GAL4-UAS. B) Zapis wewnątrzkomórkowy z mięśnia M6. Impulsy światła niebieskiego 40 ms (przy 127 μW /mm2) niezawodnie wywołują duże potencjały synaptyczne (gwiazdki) w M6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne etapy obejmują zarówno wstępną sekcję, jak i wnikanie do komórek mięśniowych. Jeśli nerwy zostaną przecięte lub mięśnie zostaną uszkodzone podczas początkowej sekcji, trudno jest kontynuować resztę eksperymentu. Podczas sekcji należy bardzo uważać, aby podczas nacięcia grzbietowego jak najbardziej pochylić nożyczki preparacyjne do góry. Podczas drugiego kluczowego kroku, czyli wniknięcia do komórki mięśniowej, należy uważać na hiperpolaryzację powyżej ~30 mV. Wartości powyżej -30 mV wskazują, że elektroda albo ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health RO1GM-33205 i MH-067284 dla L.C. Griffith oraz przez letnie stypendium badawcze Brandeis University dla N. J. Hornsteina. Wstępne eksperymenty z tą techniką przeprowadzono w Morskim Laboratorium Biologicznym w ramach letniego kursu Neural Systems and Behavior 2008 (grant NIMH: R25 MH059472) w Woods Hole w stanie Massachusetts.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SylgardEllsworth Adhesives4019862www.ellsworth.com
Minutens PinsFine Science Tools26002-10www.finescience.com
Naczynie do preparowaniaFisher Scientificwww.fishersci.com
Neuroprobe Wewnątrzkomórkowy wzmacniacz i główny stopieńA-M Systems680100www.a-msystems.com
Powerlab 4/30figure-materials-1 ADInstrumentswww.adinstruments.com
Stymulator trawyGrass Technologies www.grasstechnologies.com
Komputer stacjonarnyDellwww.dell.com
Zakres sekcyjnyLeica Microsystemswww.leica-microsystems.com
Źródło światłaDolan-Jenner Industries41446-062www.dolan-jenner.com
Fly Media
All-Trans-RetinalSigma-Aldrich116-31-4www.sigmaaldrich.com
>OK-371 Gal4 MuchyBloomington Stock center
UAS-ChR2 Laboratorium FliesFiala, obwód
Wbudowany w laboratoriumhttp://www.ledsupply.com
http:// www.futureelectronics.com
Skład:
1. 200 mA Buck Puck
2. Niebieska dioda LED
3. Drut izolowany
4. Płytka stykowa
LED RadiatorThorlabs Inc.http://www.thorlabs.com/
Air TableTMChttp://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html
Klatka Faradayazbudowana w laboratorium
Griffith Leica Mikromanipulator Leitz MLeica MicrosystemsACS01www.leica-microsystems.com
Uchwyt elektrodyAxon Instrumentswww.axon.com
Szkło borokrzemianoweFHC, Inc.www.fh-co.com/p14-15.pdf
Ściągacz elektrodSutter Instrument Co.www.sutter.com
HL 3.1 Sól fizjologiczna z 0,8 mM Ca2+Zawartość (mM):
NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0,8
MgCl2:4Sacharoza:115
NaHCO3: 10 Trehaloza: 5 narzędzi do mikropreparacji HEPES
do precyzyjnej naukiwww.finescience.com
sterownika LED laboratorium Griffith Griffitha Narzędzia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).
  2. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).
  3. Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).
  4. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).
  5. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).
  6. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).
  7. Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707(1995).
  8. Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Channelrhodopsin2Drosophila Neuromuscular JunctionSynaptic PotentialsGAL4 UAS SystemBlue Light StimulationElectrophysiology RigMuscle RecordingLarval DissectionExcitatory Junctional PotentialAll Trans Retinol

Powiązane artykuły