Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stymulacja potencjałów synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych Drosophila za pośrednictwem kanalorodopsyny 2

13.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1133

⸱

16 marca 2009

 ,  , 
1Department of Biology, Brandeis

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszej procedurze wykorzystano aktywowany niebieskim światłem kanał glonowy oraz narzędzia do specyficznej dla komórek ekspresji genetycznej w celu wywołania potencjałów synaptycznych za pomocą impulsów świetlnych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) u larw Drosophila. Technika ta stanowi niedrogą i łatwą w użyciu alternatywę dla stymulacji elektrodami ssącymi w badaniach nad fizjologią synaptyczną w laboratoriach badawczych i dydaktycznych.

Streszczenie

TheDrosophilapreparat nerwowo-mięśniowy larwy okazał się użytecznym narzędziem do badania fizjologii synaptycznej1,2,3Obecnie jedynym dostępnym sposobem wywoływania pobudzeniowych potencjałów złączeniowych (EJP) w tej preparacji jest zastosowanie elektrod ssących. Zarówno w laboratoriach badawczych, jak i dydaktycznych, studenci często mają trudności z manewrowaniem i manipulowaniem tego typu elektrodami stymulującymi. W niniejszej pracy pokazujemy, jak zdalnie stymulować potencjały synaptyczne w larwalnym NMJ bez użycia elektrod ssących. Poprzez ekspresję channelrhodopsin2 (ChR2)4,5,6 w Drosophilaneurony ruchowe przy użyciuGAL4-UAS system 7or wprowadzając niewielkie zmiany w podstawowym zestawie do elektrofizjologii, zdołaliśmy niezawodnie wywoływać EJP za pomocą impulsów niebieskiego światła. Technika ta może być szczególnie użyteczna w laboratoriach dydaktycznych z zakresu neurofizjologii, gdzie czas praktyki studentów z aparaturą oraz dostępne zasoby są ograniczone.

Protokół

Część 1: Opieka nad zwierzętami i krzyżówki genetyczne

  1. Utrzymywać linie muszek UAS-ChR2 oraz OK371-GAL4 w oddzielnych butelkach zawierających standardową pożywkę dla muszek 8.
  2. zebrać dziewice z linii OK371-GAL4 oraz samce z linii UAS-ChR2.
  3. Przenieść samce i samice do fiolki zawierającej standardową pożywkę dla muszek zmieszaną z 1 mM all-trans retinalu (ATR). Pożywkę z ATR należy przygotować, najpierw roztopiąc zwykłą pożywkę dla muszek w mikrofalówce przez ok. 1 minutę. Po roztopieniu odstawić do ostygnięcia na około 30 sekund do jednej minuty, a następnie dodać 100 μl 100 mM ATR w 100% ETOH na każde 10 ml pożywki. Fiolki umieścić na lodzie, a następnie przechowywać w ciemnym miejscu w temperaturze 4°C.
  4. Pozostawić muszki do kopulacji i składania jaj w ciemnym miejscu w temperaturze 22-25°C.
  5. Odczekać 3-4 dni, aż pojawią się larwy trzeciego stadium; w tym momencie usunąć dorosłe muszki.

Część 2: Konfiguracja zestawu

  1. Zamocuj dowolny okular mikroskopu stereoskopowego 10x (w naszym przypadku firmy Carl Zeiss Inc., www.zeiss.com, Thornwood, NY) do niebieskiego źródła światła LED z radiatorem (Thor labs, www.thorlabs.com, Newton, NJ). Przymocuj całość do podstawy magnetycznej za pomocą słupka i zacisku. Przykryj radiator ekranem uziomowanym elektrycznie, aby zredukować szumy elektryczne generowane przez źródło światła.
  2. Umieść podstawę magnetyczną ze źródłem światła na stole pneumatycznym zestawu do elektrofizjologii.
  3. Podłącz źródło światła do obwodu sterującego, a obwód sterujący do zewnętrznego źródła napięcia (Powerlab 4/30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).
  4. Podawaj impulsy 1-5 V do obwodu sterującego, aby aktywować niebieskie światło.
  5. Reguluj położenie podstawy magnetycznej i źródła światła, aż wiązka niebieskiego światła zostanie skupiona na obszarze, w którym przeprowadzana będzie sekcja larwy.

Część 3: Disekcja

  1. Wbij sześć szpilek entomologicznych 0,1 mm w dno naczynia wyłożonego sylgardem.
  2. Wyjmij larwę w 3rd stadium z podłoża pożywkowego i umieść w dowolnej plastikowej płytce Petriego.
  3. Opłucz larwę solą fizjologiczną, aby usunąć resztki pokarmu.
  4. Umieść larwę w naczyniu do sekcji w pobliżu wbitych szpilek i wypełnij naczynie solą fizjologiczną do ½ poziomu.
  5. Uorientuj larwę tak, aby widoczne były dwie srebrzyste rurki (tchawice) biegnące wzdłuż grzbietowej strony zwierzęcia.
  6. Wbij dużą szpilkę bezpośrednio w odwłok pomiędzy rurkami tchawic. Przytrzymaj larwę i wbij drugą dużą szpilkę w głowę, dbając o to, aby ciało było rozciągnięte wzdłuż jego osi.
  7. Wykonaj niewielkie nacięcie w pobliżu odwłoka, a następnie kontynuuj je wzdłuż ciała. Upewnij się, że końcówki nożyczek są uniesione, aby nie przeciąć przypadkowo nerwów brzusznych i/lub mięśni ściany ciała.
  8. Wbij cztery szpilki w czterech rogach teraz otwartej środkowej części ciała zwierzęcia. Przymocuj je do naczynia do sekcji w taki sposób, aby rozpołowić zwierzę. Napięty preparat musi być dobrze unieruchomiony.
  9. Za pomocą pęsety i nożyczek usuń jelita, tchawice i ciała tłuszczowe zwierzęcia.
  10. Opłucz preparat solą fizjologiczną.
  11. Zlokalizuj płaty czołowe (widoczne na Rys. A) oraz zwoj brzuszny preparatu.
  12. Używając mikronożyczek, ostrożnie przetnij zwoj brzuszny tuż za płatami czołowymi.

Część 4: Rejestracja aktywności mięśni i stymulacja światłem niebieskim

  1. Wytwarz elektrodę o średnicy 10-20 μω za pomocą elektronicznego wyciągacza elektrod (Sutter Instruments).
  2. Wypełnij wyciągniętą elektrodę 3 M KCl.
  3. Umieść wypełnioną elektrodę w uchwycie i za pomocą mikromanipulatora skieruj końcówkę elektrody w stronę preparatu larwalnego pod mikroskopem stereoskopowym na stanowisku do elektrofizjologii.
  4. Zidentyfikuj mięsień 6 (M6) w dowolnym segmencie ściany ciała (Rys. A).
  5. Ostrożnie wprowadź elektrodę do M6 i obserwuj gwałtowną hiperpolaryzację. Potencjały spoczynkowe błony mięśniowej powinny mieścić się w zakresie od -30 mV do -70 mV.
  6. Ustaw światło niebieskie tak, aby preparat znajdował się w centrum wiązki światła.
  7. Podawaj impulsy napięcia o czasie trwania 20-100 ms do obwodu sterującego. Stopniowo zwiększaj napięcie dostarczane do obwodu sterującego. Obserwuj pobudzające potencjały złączeniowe w komórce mięśniowej (Rysunek 1B).

Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1A przedstawia schemat układu rejestracyjnego oraz preparat z usuniętą skórą. Rysunek 1B przedstawia typowy EJP wywołany krótkimi impulsami światła. Przedstawiona amplituda EJP jest sumaryczną amplitudą z dwóch neuronów ruchowych, o których wiadomo, że oba unerwiają M6. Niższe natężenia światła aktywowały tylko jedną jednostkę ruchową (dane nie zostały przedstawione).

Schemat eksperymentu optogenetycznego: układ stymulacji nerwu i wykres odpowiedzi napięciowej, impuls 40 ms.

Rycina 1: A) Ogólny schemat układu do rejestracji wewnątrzkomórkowej z niebieską diodą LED. Mózg (Br) zostaje usunięty, aby zahamować aktywność rytmiczną w zwoju brzusznym (VG). ChR2 jest eksprymowana w neuronach ruchowych z wykorzystaniem systemu GAL4-UAS. B) Rejestracja wewnątrzkomórkowa z mięśnia M6. 40 ms impulsy niebieskiego światła (o natężeniu 127 µW / mm2) niezawodnie wywołują duże potencjały synaptyczne (gwiazdki) w M6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe etapy obejmują zarówno wstępną sekcję, jak i wprowadzenie do komórek mięśniowych. Jeśli podczas wstępnej sekcji dojdzie do przecięcia nerwów lub uszkodzenia mięśnia, kontynuowanie dalszej części eksperymentu jest utrudnione. Podczas sekcji należy zachować szczególną ostrożność i kierować nożyczki sekcyjne tak bardzo w górę, jak to możliwe, podczas nacięcia grzbietowego. W drugim kluczowym kroku, czyli wprowadzaniu do komórki mięśniowej, należy obserwować hiperpolaryzację przekraczającą ~30 mV. Wartości powyżej -...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health RO1GM-33205 oraz MH-067284 przyznane L.C. Griffith oraz przez letnie stypendium badawcze dla studentów Uniwersytetu Brandeis przyznane N. J. Hornstein. Wstępne eksperymenty dla tej techniki zostały przeprowadzone w Marine Biological Laboratory w ramach letniego kursu Neural Systems and Behavior w 2008 roku (grant NIMH: R25 MH059472) w Woods Hole, MA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SylgardEllsworth Adhesives4019862www.ellsworth.com
Pins MinutensFine Science Tools26002-10www.finescience.com
Płytka do sekcjiFisher Scientificwww.fishersci.com
Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy i głowica NeuroprobeA-M Systems680100www.a-msystems.com
System akwizycji danych Powerlab 4/30figure-materials-1 ADInstrumentswww.adinstruments.com
Stymulator GrassGrass Technologieswww.grasstechnologies.com
Komputer stacjonarnyDellwww.dell.com
Mikroskop do sekcjiLeica Microsystemswww.leica-microsystems.com
Źródło światłaDolan-Jenner Industries41446-062www.dolan-jenner.com
Pożywka dla muszek
All-Trans-RetinalSigma-Aldrich116-31-4www.sigmaaldrich.com
OK-371 Gal4 MuszkiBloomington Stock center
UAS-ChR2 MuszkiFiala lab, Griffith lab
Układ sterujący LEDZbudowany w Griffith labhttp://www.ledsupply.com
http://www.futureelectronics.com
Składa się z:
1. Przetwornica Buck Puck 200 mA
2. Niebieska dioda LED
3. Przewód izolowany
4. Płytka stykowa
Radiator LEDThorlabs Inc.http://www.thorlabs.com/
Stół pneumatycznyTMChttp://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html
Klatka FaradayaZbudowana w Griffith lab
Mikromanipulator Leica Leitz MLeica MicrosystemsACS01www.leica-microsystems.com
Uchwyt do elektrodAxon Instrumentswww.axon.com
Szkło borokrzemoweFHC, Inc.www.fh-co.com/p14-15.pdf
Wytwornica elektrodSutter Instrument Co.www.sutter.com
Sól fizjologiczna HL 3.1 z 0.8mM Ca2+Skład (mM):
NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8
MgCl2:4 Sucroza:115
NaHCO3: 10 Trehaloza: 5 HEPES
Narzędzia do mikrosekcjiFine Science Toolswww.finescience.com

Bibliografia

  1. Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).
  2. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).
  3. Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).
  4. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).
  5. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).
  6. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).
  7. Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707(1995).
  8. Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Złącze nerwowo-mięśniowe Drosophilasystem GAL4-UASstymulacja światłem niebieskimzestaw do elektrofizjologiirejestracja z mięśniasekcja larwypobudzający potencjał złączeniowyall-trans-retinol
Stymulacja potencjałów synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych Drosophila za pośrednictwem kanalorodopsyny 2
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.