Wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkanki mięśniowej

Podsumowanie

W niniejszej pracy przedstawiamy sposób wytwarzania konstruktów tkankowych na bazie kolagenu zawierających mioblasty szkieletowe. Te trójwymiarowe konstrukty inżynieryjne mogą być wykorzystywane do zastępowania lub naprawy tkanek in vivo. Na potrzeby naszych badań zaprojektowaliśmy je jako przekaźnik elektryczny przedsionkowo-komorowy do leczenia całkowitego bloku serca^[1].

Streszczenie

Mimo że elektroniczne rozruszniki serca są ratującymi życie urządzeniami medycznymi, ich długoterminowe funkcjonowanie u pacjentów pediatrycznych może być problematyczne ze względu na ograniczenia wynikające z niewielkich rozmiarów organizmu dziecka oraz jego nieuniknionego wzrostu. W związku z tym istnieje rzeczywista potrzeba opracowania innowacyjnych terapii zaprojektowanych specjalnie dla pacjentów pediatrycznych z zaburzeniami rytmu serca. Proponujemy, aby przewodząca alternatywa biologiczna, składająca się z macierzy kolagenowej zawierającej komórki pochodzenia autologicznego, mogłaby lepiej dostosować się do wzrostu, zmniejszyć potrzebę przeprowadzania powtórnych operacji i znacznie poprawić jakość życia tych pacjentów. W niniejszej pracy opisujemy procedurę inkorporacji pierwotnych kultur komórek mioblastów szkieletowych w macierz hydrożelową w celu stworzenia tkankowego konstruktu do implantacji chirurgicznej, który będzie służył jako przewód elektryczny między górnymi i dolnymi jamami serca. Ostatecznie planujemy wykorzystanie tego typu tkanki inżynieryjnej do przywrócenia przewodnictwa elektrycznego przedsionkowo-komorowego u dzieci z całkowitym blokiem serca. W tym celu izolujemy mioblasty z mięśni szkieletowych noworodków szczurów szczepu Lewis i wysiewamy je na naczynia do hodowli tkankowej pokryte lamininą, stosując zmodyfikowaną wersję uznanych protokołów^{[2, 3]}Po jednym lub dwóch dniach hodowlane komórki są zbierane i mieszane z antybiotykami, kolagenem typu 1, Matrigelem™ oraz NaHCO₃Wynikiem jest lepki, jednorodny roztwór, który można odlać do formy niemal dowolnego kształtu i rozmiaru^{[1, 4, 5]}W przypadku naszych konstruktów tkankowych wykorzystujemy kolagen typu 1 wyizolowany ze skóry płodu owczego zgodnie ze standardowymi procedurami^[6]Po zastygnięciu tkanki w temperaturze 37°C, do płytki ostrożnie dodaje się pożywkę hodowlaną, aż konstrukt zostanie całkowicie zanurzony. Następnie pozwala się na dalszą kondensację sztucznie wytworzonej tkanki poprzez odwodnienie przez kolejne 2 dni, po których jest ona gotowa doin vitroocena lub implantacja chirurgiczna.

Protokół

Część 1: Montaż form do odlewania konstruktu

1. Za pomocą żyletki rozciąć wzdłuż rurkę silikonową (VWR) i pociąć ją na odcinki o długości 3 cm.
2. Nanieść kroplę silikonowego kleju RTV klasy implantacyjnej (Rhodia) na wewnętrzną stronę każdego końca rurki.
3. Szybko przyłożyć mały fragment (1 cm x 1 cm) siatki poliestrowej (McMaster-Carr) do kropli kleju silikonowego i wyrównać go z końcem rurki. Zapewni to lekko wypukłą i płaską powierzchnię do mocowania konstrukcji. Powtórzyć czynność dla drugiego końca.
4. Pozostawić formy do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Zaleca się przygotowanie od 20 do 30 form jednocześnie, ponieważ są one w zasadzie jednorazowe.
5. Po całkowitym wyschnięciu kleju przechowywać formy w zlewce wypełnionej 70% etanolem do momentu ich użycia. Ten krok pomoże w sterylizacji form; gotowy produkt przedstawiono na Rysunku 1.

Część 2: Przygotowanie do izolacji komórek mioblastów

1. Rozpuścić 1 mg lamininy (Sigma) w 250 mL 0,22 μm filtrowanego sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) zawierającego 1% penicyliny/streptomycyny (Invitrogen) i 1% Fungizone (Invitrogen).
2. Pokryć płytki do hodowli tkanek o średnicy 150 mm (BD Falcon) 4 mL rozcieńczonego roztworu lamininy z kroku 1.1 i inkubować w temperaturze 37ºC przez co najmniej 4 godziny przed wysianiem pierwotnych mioblastów szkieletowych.
3. Przygotować pożywkę dla mioblastów, mieszając pożywkę Ham’s F-10 Nutrient Mixture (Sigma) z 20% FBS (Atlanta Biologicals), 5 ng/L podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (Promega), 1% penicyliny/streptomycyny (Invitrogen) i 1% Fungizone (Invitrogen).
4. Przygotować roztwór do trawienia mięśni szkieletowych, rozpuszczając 1 g kolagenazy 2 (~295 U/mg; Worthington) w 100 mL dyspazy-2 (2,4 U/mL; Roche). Dodać 0,037 g CaCl₂ i dokładnie wymieszać. Przefiltrować bufor do trawienia za pomocą dysku filtrującego 0,2 µm założonego na strzykawkę 10 mL i przechowywać alikwoty w temperaturze -20°C. Ilość potrzebną do trawienia tkanek pozostawić w temperaturze 37°C wraz z pożywką dla mioblastów.

Część 3: Izolacja mioblastów z mięśnia szkieletowego

1. Za pomocą pęsety i małych nożyczek usunąć mięśnie przykręgosłupowe z martwych noworodków szczurów szczepu Lewis, wykonując nacięcie wzdłuż grzbietu wzdłuż rdzenia kręgowego, odchylając skórę i warstwy powięzi, a następnie wycinając mięśnie.
2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza umieścić wycięte mięśnie w probówce stożkowej 50 mL (BD Falcon) wypełnionej 40 mL 1X zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) (Invitrogen) w lodzie. Pozostawić paski mięśniowe do osadzenia się na dnie probówki, a następnie ostrożnie usunąć większość cieczy i pozostałości krwi za pomocą odsysania próżniowego sterylną pipetą Pasteura w komorze do hodowli (Baker).
3. Przenieść pobrane fragmenty mięśni na szalkę hodowlaną 150 mm i usunąć za pomocą odsysania jak najwięcej pozostałej cieczy. Używając dwóch jednostronnych żyletek, rozdrobić tkankę do postaci gęstej papki. Wylać uprzednio ogrzany roztwór do trawienia na papkę i przenieść mieszaninę do nowej probówki 50 mL za pomocą pipety 10 mL. Podczas trawienia enzymatycznego tkankę okresowo homogenizować (bez napowietrzania) pipetą 10 mL zamontowaną do bezprzewodowego kontrolera pipet Pipette-Aid (Drummond). Ponownie pozostawić tkankę do osadzenia i usunąć nadmiar cieczy.
4. Umieścić probówkę na platformie kołyszącej i trawić w temperaturze 37ºC przez około 30 min.
5. Po upłynnieniu mięśni przefiltrować roztwór przez sitko komórkowe 70 μm (BD Falcon) i wirować w temperaturze pokojowej przez 10 min przy 600 x g (Beckman GP). Za pomocą pipety Pasteura i odsysania usunąć jak najwięcej cieczy, a następnie resuspender osad w 10 mL ciepłego medium do mioblastów.
6. Przeprowadzić wstępne wysianie (pre-plating) komórek na niepowlekanej płytce do hodowli tkankowej 150 mm przez 15 minut, aby pomóc w usunięciu fibroblastów.
7. Przenieść komórki, które nie przywarły jeszcze do podłoża, na naczynia hodowlane powleczone lamininą i rozcieńczyć tak, aby przypadała jedna płytka na 1 do 2 noworodków szczura. Umieścić płytkę w inkubatorze z nawilżaniem, ustawionym na 37 °C i 5% CO₂.

Część 4: Odlewanie inżynieryjnych konstruktów tkankowych (5 mL)

1. Po 1-2 dniach wyjmij z inkubatora 10 płytek hodowlanych z mioblastami o średnicy 150 mm, przemyj je dwukrotnie 1X PBS o temperaturze 37°C i dodaj do każdej płytki 4 mL podgrzanej 0,05% trypsyny-EDTA. Włóż płytki z powrotem do inkubatora na 5 min.
2. Zbierz oddzielone mioblasty z płytek w komorze z laminarnym przepływem powietrza i przelej ciecz do probówki 50 mL (BD Falcon). Użyj 10 mL pożywki do mioblastów, aby wypłukać wszystkie płytki, a następnie połącz ten roztwór z komórkami w probówce do wirowania. Odwiruj komórki w temperaturze pokojowej przez 10 min przy 600 x g (Beckman GP) i usuń nadmiar cieczy zgodnie z opisem w kroku 3.5.
3. Resuspenduj komórki mioblastów w 1,6 mL pożywki do mioblastów i umieść na lodzie.
4. Używając pęsety, ostrożnie wyjmij 4 formy do konstruktów z kroku 1.5 i przemyj je dwukrotnie 1X PBS. Usuń wszystkie ślady PBS za pomocą pipety Pasteura i odsysacza próżniowego przed umieszczeniem każdej formy w 6-dołkowej płytce hodowlanej (BD Falcon).
5. Przygotuj na lodzie pozostałe odczynniki potrzebne do przygotowania konstruktu (10X Ham’s F10, antybiotyki, kolagen typu 1 [3,9 mg/mL]^[6] oraz Matrigel™), a pożywkę do mioblastów utrzymuj w temperaturze 37ºC. Połącz 500 μL 10X Ham’s F10, 100 µL penicyliny/streptomycyny, 100 µL Fungizone, 1,6 mL kolagenu i 750 µL Matrigel™ w stożkowej probówce 15 mL. Mieszaj roztwór przez 10 s za pomocą mini-vortexera (VWR) ustawionego na 10 i umieść na lodzie.
6. Następnie dodaj 80 µL NaHCO₃ oraz zawiesinę mioblastów z kroku 3.3 do mieszaniny z kroku 3.5. Wymieszaj całą zawiesinę na vortexerze przez 10 s i wstaw probówkę z powrotem do wiadra z lodem na kilka minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu.
7. Ostrożnie wlej mieszaninę do form za pomocą pipety 10 mL, zanim zacznie ona twardnieć. Każda forma pomieści około 1 mL gęstej cieczy. Staraj się nie wprowadzać pęcherzyków powietrza podczas tej procedury.
8. Ostrożnie przenieś płytkę z odlanymi konstruktami do inkubatora. Po około 30 min wyjmij utwardzone konstrukty z inkubatora i ostrożnie dodaj do każdego dołka pożywkę do mioblastów, aby przykryć konstrukt tkankowy. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora (Rysunek 2).

Część 5: Reprezentatywne wyniki

Po prawidłowym wykonaniu niniejszego protokołu konstrukt tkankowy zawierający mioblasty jest gotowy do implantacji in vivo (tj. po wyjęciu z formy) lub do dalszych analiz in vitro po 2 dniach.

Rycina 1. Przykłady gotowych form konstruktów (patrz Krok 1.5).

Rysunek 2. Utwardzony konstrukt tkankowy zawierający mioblasty^[1].

Rysunek 3. Przekroje konstrukcji tkankowej zawierającej mioblasty, barwione H&E. "A" przedstawia przekrój podłużny, a "B" przedstawia przekrój poprzeczny.

Dyskusja

Formy, w których odlewany będzie konstrukt tkankowy, mogą mieć dowolny kształt i rozmiar; konieczne jest jednak zapewnienie co najmniej dwóch punktów mocowania. W przeciwnym razie macierz i komórki tworzą strukturę sferyczną, co prowadzi do obumarcia komórek. W niniejszym protokole opisujemy zastosowanie siatki poliestrowej w tym celu, choć z powodzeniem stosowaliśmy również siatkę ze stali nierdzewnej. Oczywiście większe formy będą wymagały większej liczby komórek oraz większej objętości pozostałych składników. Podczas ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przewody silikonowe	VWR international	60985-724
Klej silikonowy	Rhodia Silicones	MED ADH 4300 RTV
Siatka poliestrowa	McMaster-Carr	93185T17
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
Pożywka nutrient mixture F-10 HAM	Sigma-Aldrich	N6908
Płytkowa surowica bydlęca (Fetal Bovine Serum)	Atlanta Biologicals	S11550
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140
Fungizone	Invitrogen	15290-018
Dyspaza-2	Roche Group	10295825001
Kolagenaza 2	Worthington Biochemical	46H8863
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (Basic Fibroblast Growth Factor)	Promega Corp.	G5071
Szalki hodowlane 150 mm	BD Biosciences	353025
0.05% (1X) Trypsyna-EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25300
1X Zrównoważony roztwór soli Hanksa (Hanks Balanced Salt Solution)	Invitrogen	14170-112
7.5% NaHCO3	GIBCO, by Life Technologies	25080-094
Sito do komórek 70 μm	BD Biosciences	352350
Płytki 6-dołkowe	BD Biosciences	353046
Probetka stożkowa 50 mL	BD Biosciences	352098
Probetka stożkowa 15 mL	BD Biosciences	352099
Filtr 0.2 μm	Nalge Nunc international	194-2520