$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Część 1: Przygotowanie tkanek
- Naszym celem jest przygotowanie preparatu tkankowego z larw muchy, w którym układ nerwowy pozostaje nienaruszony, ale wewnętrzna powierzchnia mięśni ściany ciała jest wystawiona na działanie sztucznej hemolimfy i może zostać umieszczona blisko szkiełka przedmiotowego mikroskopu w celu uzyskania dobrej jakości obrazu. Innymi słowy, chodzi o preparat larwy wywiniętej na lewą stronę.
Ponieważ konwencjonalne przygotowania tkanek wiążą się z rozcinaniem, przypinaniem i rozciąganiem mięśni ściany ciała, a niekiedy z usuwaniem części układu nerwowego, potrzebowaliśmy innego podejścia.
Zależało nam na wywinięciu zwierząt na lewą stronę, aby dokładnie przyjrzeć się cechom strukturalnym i zmianom strukturalnym w synapsie w czasie, zachowując jednocześnie nienaruszony układ nerwowy. Chcieliśmy również uniknąć rozciągania tkanki i aktywacji receptorów rozciągania, co powodowałoby drgania mięśni i psuło obraz.
- Na początek przygotuj zwierzęta. Larwy w trzecim stadium żerowania oraz larwy w trzecim stadium wędrówki są duże i łatwe do wypreparowania, dlatego demonstrację przeprowadzimy na larwach W3. Zwierzę to posiada fenotyp Tubby i jest szerokie, co ułatwia jego wywinięcie.
Używaliśmy wyłącznie larw, które aktywnie się poruszały, w tym larw W3.
- Oczyść powierzchnię larwy bardzo miękkim pędzlem w szalce Petriego z podwójnie destylowaną H2O. Oczyszczone larwy zapewniają lepszą jakość obrazu, a czyszczenie redukuje ilość bakterii.
- Przenieś zwierzę do małej szalki Petriego zawierającej około 3 ml lodowatego HL-6, czyli sztucznej hemolimfy. Pozostaw szalkę na lodzie, aż zwierzę przestanie się poruszać i rozluźni (około 5 minut).
- Trzymaj bardzo cienkie pęsety w jednej ręce, a nożyczki sprężynowe w drugiej. Nożyczek używam w ręce dominującej. Zrób nożyczkami mały otwór w ścianie ciała, aby wyrównać ciśnienie wewnątrz i na zewnątrz ściany ciała.
- Delikatnie przytrzymaj zwierzę pęsetą przy dnie szalki i odetnij dwa tylne segmenty. Wypreparuj trzewia; ciało tłuszczowe prawdopodobnie wysunie się z jamy ciała. Usuń również tę tkankę.
- Przytrzymaj larwę przy dnie szalki cienką pęsetą. Weź szpilkę entomologiczną #0 (z tępym czubkiem) i dociśnij ją do części gębowych larwy. Przepchnij części gębowe przez jamę ciała, tak jakbyś wywijał skarpetkę na lewą stronę.
- Wytworzona tkanka wywinięta na lewą stronę będzie wyglądać jak na poniższej rycinie. Za pomocą ultra-cienkiego narzędzia do dysekcji usuń ciało tłuszczowe i tchawki ze ściany ciała. Bardzo staraj się nie pociągać za tchawki ani nie uszkodzić układu nerwowego. Zerwanie tchawki spowoduje powstanie dziur w mięśniach ściany ciała.
Usuń jak największą ilość ciała tłuszczowego. Obie te struktury pogarszają jakość optyczną tkanki. Przed wykonaniem tego przygotowania warto zrezygnować z picia kawy.
- Po zakończeniu mięsień będzie przezroczysty, a nie nieprzezroczysty lub biały. Jeśli umieścisz preparat tkankowy w HL-6 bez glutaminianu, w temperaturze pokojowej, prawdopodobnie będzie on rytmicznie kurczył się, ponieważ generatory wzorców ruchowych w OUN są aktywne.
Unikaj używania preparatów z ewidentnie skurczonymi lub nieregularnie skurczonymi mięśniami ściany ciała.
Nienaruszona ściana ciała wywinięta na lewą stronę ma tendencję do składania się na pół wzdłuż linii środkowej grzbietowej i brzusznej, w związku z czym preparat pozwala na wizualizację lewej lub prawej „hemi-zwierzęcia”.
- 1.9 Zamocuj tkankę w komorze komercyjnej o małej objętości, takiej jak komora Warnera, lub na szkiełku mikroskopowym z mostkowym układem szkiełka nakrywkowego. Sugestie dotyczące mocowania tkanek znajdują się w części 3.
Część 2: Znakowanie butonów neuronalnych za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko HRP znakowanego fluorescencyjnie.
- Nanieś 50 µL fluorescencyjnie znakowanego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko HRP w roztworze HL-6 w formie kropli na szalkę Petriego. Zanurz preparat wywiniętej na drugą stronę ściany ciała w kąpieli z barwnikiem. Znakowanie zakończeń neuronów może być widoczne po około 5 minutach, jednak w celu uzyskania pełnego i jasnego znakowania należy inkubować przez 10-20 minut.
- Płucz preparat w roztworze HL-6 przez 10-30 sekund w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar barwnika. Niezwiązany barwnik zostaje szybko wypłukany, więc cykl płukania nie musi być intensywny.
- W razie potrzeby dostosuj stężenie barwnika oraz czas inkubacji.
Część 3: Znakowanie przestrzeni perysynaptycznej koniugatem dekstranu z fluoroforem
- Rozcieńczyć barwnik dekstran sprzężony z fluoresceincją w roztworze HL-6. Stężenie, które sprawdziło się w naszych celach, wynosiło:
- Jeśli czas dostania się barwnika do przestrzeni zewnątrzkomórkowej nie jest krytyczny, nanieść kroplę 20 µL barwnika na „mostkową” szkiełko podstawowe (patrz część 4) i umieścić preparat w kąpieli z barwnikiem.
Część 4: Montowanie tkanki do wizualizacji (za pomocą mikroskopii konfokalnej).
Jeśli nie ma potrzeby perfuzji preparatu (krótkie obserwacje) lub chcą Państwo ograniczyć objętość kąpieli HL-6, należy zastosować metodę szkiełka z podwójnym mostkiem
Jeśli chcą Państwo przeprowadzić perfuzję preparatu, zaleca się zastosowanie komory perfuzyjnej. W naszych badaniach wykorzystaliśmy zmodyfikowaną komorę firmy Warner Instruments.
Szczegóły obu przypadków znajdują się poniżej.
Montaż preparatu na szkiełku z podwójnym mostkiem.
- Należy użyć bardzo czystego szkiełka przedmiotowego. Za pomocą superglue należy przykleić dwa kwadratowe szkiełka nakrywkowe 18 mm (#1.5) do szkiełka przedmiotowego, pozostawiając 2 mm odstępu między krawędziami nakrywek.
- Należy poczekać do całkowitego wyschnięcia kleju, w przeciwnym razie na wodnym medium wokół preparatu może utworzyć się niepożądany film.
- Larwy wywinięte na lewą stronę należy umieścić między krawędziami szkiełek nakrywkowych. W przypadku dużych larw oraz ograniczonej matrycy pikseli systemu akwizycji obrazu, może być konieczne ustawienie preparatu po przekątnej.
- Tkankę należy przykryć bardzo czystym szkiełkiem nakrywkowym #1.5, 18 mm. „Górną” nakrywkę należy przykleić do szkiełka przedmiotowego i bocznych nakrywek za pomocą minimalnej ilości wazeliny.
- Na górną nakrywkę należy nanieść kroplę specjalistycznego oleju immersyjnego Cargill o współczynniku załamania światła 1.3379 (w przypadku użycia HL-6), a następnie obrócić cały zespół.
- Zespół z tkanką należy umieścić na mikroskopie stroną z olejem w stronę obiektywu i ustawić ostrość obiektywu.
Montaż tkanki w zmodyfikowanej komorze perfuzyjnej.
- Do komory RC 20 należy przykleić szkiełko nakrywkowe 1.5, tworząc dno. Tkankę należy umieścić w komorze zgodnie z instrukcją obsługi RC-20. Aby utworzyć górną część komory, zamiast szkiełka nakrywkowego należy użyć kawałka siatki Nytex.
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
- Sekwencja preparowania tkanki metodą wywinięcia na lewą stronę:
Larwy W3, wypłukane (fenotyp „Tubby”) ( 5.1.1). Larwy W3, wypreparowane 2 tylne segmenty. Widać ciało tłuszczowe wypchnięte z jamy ciała przez nacisk na ścianę ciała (strzałka). Należy starać się zminimalizować „erupcję” trzewną, wykonując niewielki otwór w ścianie ciała na 1 minutę przed sekcją ( 5.1.2). Preparat z wypreparowanymi trzewiami przed wywinięciem na lewą stronę (5.1.3). Preparat, w większości wywinięty, ze szpilką (strzałka) wewnątrz światła preparatu (5.1.4). Mięsień znajduje się teraz na zewnątrz, a kutykula wewnątrz, z przyczepionymi fragmentami ciała tłuszczowego i tracheolami (5.1.5). W pełni wypreparowany preparat tkankowy z usuniętą niemal całą częścią ciała tłuszczowego i tracheolami (5.1.6).
- Znakowanie na żywo z użyciem anty-HRP w larwalnym NMJ. Reprezentatywna synapsa nerwowo-mięśniowa larwy W3 z wypustką glejową (preparat wywinięty na lewą stronę). Zakończenia butonów neuronu ruchowego są znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko HRP (magenta), które jest sprzężone z Cy5. Wypustki glejowe są znakowane GFP (zielony).
- Przestrzeń perysynaptyczna zwizualizowana fluorescencyjnie za pomocą dekstranu Alexa 680 w preparacie wywiniętym na lewą stronę. Wypustka glejowa (zielona) jest znakowana GFP targetowanym do błony. Postsynaptyczne SSR na powierzchni mięśnia (niebieski) jest znakowane dsRed. Dekstran Alexa (czerwony) koncentruje się w obszarach zewnątrzkomórkowych. Barwnik dekstran tworzy baseny w kształcie pączka w przestrzeniach perysynaptycznych. Znakowanie dekstranem oraz znakowane dsRed SSR są przedstawione w skali szarości. Zwróć uwagę na liczne baseny barwnika w kształcie pączka podkreślające przestrzenie perysynaptyczne (strzałka).