Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Podsumowanie

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Streszczenie

Neurotransmisja jest procesem, w którym neurony przekazują informacje za pomocą sygnałów chemicznych do swoich celów postsynaptycznych w bardzo krótkim czasie. Ten złożony proces wymaga skoordynowanej aktywności wielu białek presynaptycznych i postsynaptycznych, aby zapewnić odpowiednią łączność synaptyczną, przewodzenie sygnałów elektrycznych, celowanie i przygotowanie pęcherzyków wydzielniczych, detekcję jonów wapnia, fuzję pęcherzyków, lokalizację i funkcję receptorów postsynaptycznych, a na koniec mechanizmy recyklingu. Jako neuronaukowcy dążymy do wyjaśnienia, które białka funkcjonują w każdym z tych etapów i do zrozumienia ich mechanizmów działania. Rejestracje elektrofizjologiczne z synaps zapewniają mierzalny odczyt podstawowych zdarzeń elektrycznych zachodzących podczas transmisji synaptycznej. Łącząc tę technikę z potężnym zestawem narzędzi molekularnych i genetycznych dostępnych do manipulowania białkami synaptycznymi w C. elegans, możemy analizować wynikowe zmiany funkcjonalne w transmisji synaptycznej.

Złącza neuromięśniowe (NMJ) C. elegans tworzone pomiędzy neuronami ruchowymi a mięśniami ściany ciała kontrolują lokomocję, dlatego mutanty o nieskoordynowanych fenotypach lokomotorycznych (znane jako unc) często zaburzają przekaźnictwo synaptyczne w tych synapsach ¹. Ponieważ mutanty unc są utrzymywane przy obfitym dostępie do bakteryjnego źródła pokarmu, pozostają żywotne tak długo, jak zachowują pewną zdolność do pompowania gardłowego w celu pobierania pokarmu. To, wraz z faktem, że C. elegans występują jako hermafrodyty, pozwala im przekazywać mutanty potomstwu bez potrzeby stosowania złożonych zachowań kopulacyjnych. Cechy te, w połączeniu z naszą niedawną możliwością rejestracji sygnałów z NMJ nicieni ^2,3,7, czynią go doskonałym organizmem modelowym do precyzyjnego zbadania, w jaki sposób mutanty unc wpływają na neurotransmisję.

Metoda sekcji polega na unieruchomieniu dorosłych nicieni za pomocą kleju cyjanoakrylowego w celu wykonania nacięcia w kutykuli nicienia, co umożliwia odsłonięcie NMJ. Ponieważ dorosłe C. elegans mają długość zaledwie 1 mm, sekcję przeprowadza się przy użyciu mikroskopu stereoskopowego, co wymaga doskonałej koordynacji wzrokowo-ruchowej. Rejestracje z NMJ są wykonywane poprzez metodę voltage clamp w całej komórce (whole-cell) poszczególnych komórek mięśniowych ściany ciała, a uwalnianie neuroprzekaźników można wywołać za pomocą różnych protokołów stymulacji, w tym stymulacji elektrycznej, depolaryzacji za pośrednictwem aktywowanego światłem kanału rodopsyny ⁴ oraz hiperosmotycznej soli fizjologicznej; wszystkie te metody zostaną krótko opisane.

Protokół

A. Przygotowanie narzędzi wykorzystywanych do sekcji.

1. Komora do sekcji/rejestracji: Naszą komorę rejestracyjną konstruujemy zazwyczaj z 1/16^th magnetyczna blacha z wywierconym w centrum okrągłym otworem o średnicy wystarczającej do zamocowania okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy 22 mm. Wymiary zewnętrzne komory zależą od stolika mikroskopu użytego do rejestracji. Na odwrotnej stronie blachy magnetycznej mocujemy szkiełko nakrywkowe o wymiarach 48 x 60 mm, które przyklejamy do komory, umieszczając w każdym rogu szkiełka kuleczkę wosku do zatapiania tkanek Paraplax o niskiej temperaturze topnienia, tak aby znajdowała się ona pomiędzy szkłem a komorą. Następnie wosk roztapia się na płycie grzewczej (z płytą szklaną skierowaną ku górze), aż utworzy ciągłą warstwę sklejającą szkiełko z komorą. Nie należy pozostawiać tego etapu bez nadzoru, ponieważ wosk topi się szybko. Komorę należy zdjąć i schłodzić niezwłocznie po roztopieniu wosku. Nadmiar wosku, który wyciekł wzdłuż wewnętrznej krawędzi okrągłego otworu o średnicy 22 mm, można usunąć za pomocą ostrza żyletki.
2. Kryszalki pokryte Sylgardem: Disekcję przeprowadza się na kryszalku o średnicy 22 mm, pokrytym Sylgardem, który umieszcza się w okrągłej jamie komory rejestracyjnej. Powłoka z Sylgardu ułatwia przyleganie kleju cyjanoakrylowego do kryszalki podczas przyklejania nicieni, a także służy jako podkładka, o którą można odłamać końcówkę pipety z klejem w przypadku jej zapchania. Sylgard przygotowuje się na świeżo zgodnie z instrukcją producenta (10 części bazy silikonowej na 1 część utwardzacza wagowo). Następnie na każdą kryszalkę nanosi się małą kroplę Sylgardu i rozprowadza ją krawędzią żyletki, aby uzyskać równą powierzchnię. Pokryte kryszalki umieszcza się w dużych, płaskich, zamkniętych pojemnikach i pozostawia w 65° pozostawić w piekarniku przez noc w celu utwardzenia.
3. Pipety: Zazwyczaj do wyrobu pipet służących do przytwierdzania nicieni, wykonywania nacięć kutykuli oraz rejestracji z mięśni wykorzystujemy borokrzemienne włókna szklane o tej samej średnicy zewnętrznej 1 mm, używając w tym celu wyciągacza elektrod. Zaleca się przygotowanie całego zestawu pipet przed przystąpieniem do sekcji, ponieważ ten etap może wymagać kilkukrotnej, szybkiej wymiany pipet.
4. Aplikator do kleju: Klej jest pobierany i aplikowany z końcówki pipety do kleju za pomocą nacisku ustami. Pipeta do kleju jest włożona w jeden koniec 2-stopowego odcinka rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej odpowiadającej średnicy zewnętrznej szklanej pipety (zazwyczaj 1 mm). Drugi koniec rurki trzyma końcówkę do pipety Eppendorf, która pełni funkcję ustnika.
5. Pipeta do ekstrakcji: Po wykonaniu nacięcia kutykuli należy usunąć trzewia nicienia z jego jam ciała. Osiąga się to za pomocą odcinka rurki przymocowanej do końcówki pipety Eppendorf, podobnie jak w przypadku aplikatora do kleju, jednak w tym przypadku szklana końcówka pipety ekstrakcyjnej jest odpowiednio skrócona, aby umożliwić łatwe odessanie jaj i trzewi z jamy ciała nicienia.

B. Sekcja

1. W komorze rejestracyjnej, blisko jej obwodu, rysuje się okrąg woskowym pisakiem, do którego mocno dociska się pokrywkę szkiełkową powleczoną Sylgardem (warstwą Sylgardu do góry). Linia wosku unieruchamia szkiełko i zapobiega przedostawaniu się roztworu rejestracyjnego pod pokrywkę oraz jej przemieszczaniu podczas sekcji i rejestracji. Następnie komorę wypełnia się pozakomórkowym roztworem rejestracyjnym, a w jej centrum za pomocą zgłębnika do nicieni umieszcza się kilka osobników. Nicienie będą pływać w roztworze, jednak wraz z wprawą można je przyklejać bez konieczności stosowania dodatkowych procedur, takich jak chłodzenie w celu ograniczenia ruchu. Na etapie szkolenia pomocne może być ćwiczenie przyklejania nicieni mutantów z upośledzoną zdolnością pływania (np. mutantów unc-31).
2. Do przechowywania roboczego zapasu kleju cyjanoakrylowego używa się pojemnika wykonanego z nakrętki do PCR, osadzonej w wosku lub plastelinie. Do aplikowania kleju stosuje się pipety do kleju o wymiarach końcówki zbliżonych do pipet rejestracyjnych (zazwyczaj rezystancja ok. 4 MΩ). Za pomocą aplikatora niewielką ilość kleju zasysa się do pipety, obserwując końcówkę pipety przez stereomikroskop podczas zasysania.
3. Klej cyjanoakrylowy (HistoacrylBlue, Aesulap) polimeryzuje w kontakcie z pozakomórnym roztworem rejestracyjnym, dlatego ważne jest utrzymanie nadciśnienia w pipecie z klejem podczas wprowadzania jej do roztworu w komorze, aby zapobiec twardnieniu kleju i zapchaniu pipety. Gdy tylko pipeta z klejem znajdzie się w roztworze komory, należy podawać niewielki, ale stały strumień kleju na powierzchnię Sylgardu, kontrolując ciśnienie ustami, aby uniknąć zapchania. Jeśli pipeta zostanie zapchana, można czasem udrożnić ją, delikatnie stukając końcówką o szkło powleczone Sylgardem. Zaleca się ćwiczenie przyklejania przed próbami z nicieniami. Jeśli są Państwo w stanie rutynowo napisać klejem swoje imię na Sylgardzie, tworząc litery z linii cieńszych niż szerokość nicienia, można przystąpić do przyklejania kutykuli nicienia.
4. Aby przykleić nicienia, należy za pomocą nadciśnienia nanieść niewielką ilość kleju na głowę lub ogon zwierzęcia i szybko przycisnąć nicienia do powierzchni Sylgardu. Należy starać się przytwierdzić nicienia blisko centrum komory, ponieważ osobniki przyklejone zbyt blisko krawędzi będą trudne do osiągnięcia pipetami rejestracyjnymi. Następnie należy nakładać stały strumień kleju wzdłuż grzbietowej krawędzi kutykuli nicienia, zaczynając od punktu mocowania i wymuszając ugięcie nicienia w pozycję C, tak aby wulwa była skierowana do wewnątrz (w przypadku rejestracji z mięśni brzusznych). Wszelkie przerwy w linii kleju powinny zostać wypełnione, aby nicień był mocno przytwierdzony, co zapobiegnie jego odklejeniu podczas etapu nacinania kutykuli.
5. Aby wykonać nacięcie kutykuli, należy przejść na ręczną pipetę sekcyjną. Pipeta ta musi być ostrzejsza niż pipety do kleju/rejestracji i posiadać krótką, sztywną trzonową część. Używając największego powiększenia stereomikroskopu, należy ustawić pipetę równolegle do osi podłużnej nicienia i wprowadzić końcówkę w połowie długości ciała (blisko wulwy), wykonując nacięcie na styku kutykuli i kleju. Nacięcie to zwalnia ciśnienie hydrostatyczne nicienia, co powoduje wypchnięcie jaj i jelit przez punkt nacięcia. Należy kontynuować przecinanie kutykuli w kierunku głowy nicienia ruchem tnącym, podobnym do otwierania listu, aż do osiągnięcia gardła. Następnie należy użyć pipety do ekstrakcji, aby odessać organy wewnętrzne nicienia. Po oczyszczeniu nacięcia otwarta kutykula zachowa swój cylindryczny kształt. Należy użyć nowej pipety do kleju, aby punktowo przykleić przecięty brzeg kutykuli do powierzchni Sylgardu. Na tym etapie ważne jest użycie minimalnej ilości kleju w punktach mocowania, aby uniknąć uszkodzenia lub przesłonięcia połączeń neuromięśniowych (NMJs).
   Brzuszny sznur nerwowy i mięśnie ściany ciała są teraz odsłonięte.
6. Aby usunąć błonę podstawną pokrywającą NMJs, należy odessać pozakomórkowy roztwór rejestracyjny z komory i aplikować kolagenazę (0,4 mg/ml w pozakomórkowym roztworze rejestracyjnym) przez około 10-20 s; następnie usunąć enzym i kilkakrotnie przemyć świeżym pozakomórkowym roztworem rejestracyjnym. Można przejść do etapu rejestracji.

C. Rejestracja metodą patch-clamp

1. Umieść komorę pomiarową na stole mikroskopu w pozycji pionowej, używając obiektywu 10X, aby wycentrować nicienia. Przełącz na obiektyw imersyjny w wodzie 40X z DIC i sprawdź, czy mięśnie ściany ciała oraz sznur nerwowy są nieuszkodzone. Ustaw nicienia tak, aby jego oś podłużna była równoległa do przedniej krawędzi mikroskopu, co umożliwi wprowadzenie elektrod z obu stron, lewej i prawej.
2. Wykonaj patch-clamp mięśnia, stosując standardowe techniki tej metody. Dobrze sprawdzają się elektrody pomiarowe o rezystancji około 4 MΩ. Gdy elektroda dotknie błony mięśniowej, zwiększ podciśnienie, aż do uzyskania uszczelnienia rzędu gigaoma (gigohm seal). W przypadku trybu pomiarowego voltage-clamp dla całej komórki (whole-cell), zastosuj silniejsze ssanie i wykonaj impuls elektryczny (zap), aby przerwać uszczelnienie gigaomowe. W dobrym pomiarze mięśnie ściany ciała dorosłych nicieni typu dzikiego zazwyczaj wykazują pojemność błony komórkowej ~70 pF i mogą być stabilnie rejestrowane przez co najmniej 10 minut przy potencjale trzymania -60 mV przy minimalnych prądach trzymania (~50 pA).
3. Pozakomórkowy roztwór pomiarowy składa się z (w mM): NaCl 150, KCl 5, CaCl₂ 5, MgCl₂ 4, glukozy 10, sacharozy 5, HEPES 15 (pH 7,3, ~330 mOsm). Pipeta do patch-clampu zawiera (w mM): KCl 120, KOH 20, MgCl₂ 4, (kwas N-tris[hydroksymetylo]metylo-2-aminoetanosulfonowy) TES 5, dwuwodny CaCl₂ 0,25, Na₂ATP 4, sacharozy 36, EGTA 5 (pH 7,2, ~312 mOsm). Uwaga: Roztwory te sztucznie obciążają komórki mięśniowe chlorkami, przez co prądy pośredniczone przez receptory GABA są skierowane do wnętrza komórki z powodu odpływu chlorków przy potencjale trzymania -60 mV. Stosowano modyfikacje tych roztworów (szczegóły znajdują się w publikacjach).
4. Wywołane uwalnianie. Zazwyczaj umieszczamy drugą elektrodę zawierającą roztwór pozakomórkowy na brzuszny sznurze nerwowym przedmiastowo względem patchowanego mięśnia. Ta konfiguracja loose-patch wymaga dużych impulsów depolaryzacyjnych (rzędu dziesiątek woltów) o krótkim czasie trwania (1-2 ms), aby uzyskać maksymalne odpowiedzi wywołane (zazwyczaj 2,0-2,5 nA) u nicieni typu dzikiego. Ograniczeniami tego podejścia są: 1) Można wywołać tylko kilka odpowiedzi, zanim sznur nerwowy zostanie nieodwracalnie uszkodzony oraz 2) Z nieznanych przyczyn, przy tej konfiguracji stymulacji można wywołać jedynie odpowiedzi cholinergiczne.
5. Stymulacja za pomocą kanałowej rhodopsyny aktywowanej światłem. Niedawno zespół Gottschalka stworzył transgeniczne nicienie wykazujące ekspresję pochodzących z alg rhodopsyn kanałowych, które depolaryzują błonę po stymulacji światłem w podzbiorach neuronów, w zależności od promotora sterującego ekspresją ⁴. W przypadku NMJ u C. elegans dostępne są linie zintegrowane wykazujące ekspresję rhodopsyny kanałowej albo w cholinergicznych neuronach ruchowych, albo w GABAergicznych neuronach ruchowych. Ponieważ rhodopsyna kanałowa reaguje na światło tylko wtedy, gdy all-trans-retinal jest związany z częścią opsynową, nicienie wykorzystywane do tej aplikacji muszą być hodowane na bakteriach z dodatkiem retinalu. Można następnie zastosować impuls zielonego światła, aby wielokrotnie aktywować rhodopsynę kanałową, powodując wywołane uwalnianie ACh lub GABA, w zależności od zastosowanych transgenicznych nicieni. Te transgeniczne nicienie mogą być krzyżowane z liniami mutantami. Zalety tej techniki w porównaniu ze wspomnianą wcześniej stymulacją elektryczną to: 1) Aktywacja światłem nie powoduje uszkodzeń neuronów, co pozwala na wykonanie wielu powtórnych stymulacji oraz 2) Możliwość niezależnego badania wywołanego uwalniania z GABAergicznych lub cholinergicznych neuronów ruchowych.
6. Uwalnianie indukowane hiperosmotycznie. Aby zmierzyć wielkość puli pęcherzyków łatwo uwalnianych (odzwierciedlającą sumaryczną pulę pęcherzyków przygotowanych ze wszystkich NMJ w rejestrowanym mięśniu), stosuje się pipetę ciśnieniową zawierającą hiperosmotyczny roztwór pozakomórkowy (dostosowany do ~850 mOsm poprzez dodanie dodatkowej sacharozy). Aplikacje impulsów ciśnieniowych trwające 1-3 sekundy wywołują serię asynchronicznych zdarzeń postsynaptycznych przy użyciu standardowych roztworów opisanych powyżej.

Rysunek 1: Schematyczny przegląd konfiguracji sekcji C. elegans oraz rejestracji nerwowo-mięśniowej

Szkiełko nakrywkowe powlekone Sylgardem, przygotowane poprzez rozprowadzenie kropli Sylgardu po szkle i utwardzenie przez noc, umieszcza się w okrągłym zagłębieniu prefabrykowanej komory rejestracyjnej i zalewa roztworem rejestracyjnym. Niciela umieszczonego w centrum przykleja się do powierzchni Sylgardu, zaczynając od głowy lub ogona, nakładając klej na stronę grzbietową zwierzęcia za pomocą pipety do kleju. Po zakończeniu przyklejania, szklaną igłą wykonuje się nacięcie w sąsiedztwie sromki, na styku kutykuli i kleju, i przedłuża je w kierunku głowy (patrz czerwona linia przerywana). Po usunięciu trzewi i jaj z jamy ciała, krawędź nacięcia zostaje punktowo przyklejona do Sylgardu, odsłaniając nerw brzuszny (zielony) i mięśnie ściany ciała (czerwone). Mięsień brzuszno-przyśrodkowy przed sromką zostaje poddany technice patch-clamp, a elektrodę stymulującą umieszcza się powyżej na sznurze nerwowym.

Reprezentatywne wyniki

Przedstawiono rejestracje z mięśni ściany ciała w konfiguracji whole-cell z clampowaniem napięcia dla każdego z trzech opisanych powyżej protokołów stymulacyjnych (odpowiedzi wywołane elektrycznie, światłem oraz hiperosmotycznie). We wszystkich przypadkach napięcie brzustnego przyśrodkowego mięśnia ściany ciała utrzymywano na poziomie -60 mV. A. Komórki mięśniowe typu dzikiego zazwyczaj wykazują wysoką częstotliwość endogennych wewnątrzkomórkowych miniaturowych prądów synaptycznych w naszych standardowych roztworach rejestracyjnych. B. Depolaryzacja przedniego brzustnego sznura nerwowego trwająca 2ms powoduje synchroniczne uwalnianie z kilku synaps, co skutkuje dużą odpowiedzią wywołaną o wartości około 2-2,5 nA u nicieni typu dzikiego. Reprezentatywne ślady po prawej stronie zapisów typu dzikiego w A i B pokazują uwalnianie synaptyczne u mutanta z ciężkimi zaburzeniami koordynacji (unc-18). Panel C przedstawia odpowiedź wywołaną światłem ze złącza nerwowo-mięśniowego nicienia typu dzikiego wykazującego ekspresję kanałowej rhodopsyny w neuronach cholinergicznych. Impuls świetlny o czasie trwania 2ms zazwyczaj generuje odpowiedź rzędu 1,5-1,8 nA. D. Wtryskiwanie pod ciśnieniem hiperosmotycznej soli fizjologicznej 850 mOsm na mięsień przez 1s wywołuje asynchroniczną serię miniaturowych prądów synaptycznych, reprezentującą pulę pęcherzyków gotowych do uwalniania.

Dyskusja

Model genetyczny C. elegans jest idealny do badania transmisji synaptycznej poprzez funkcjonalną analizę mutacji w genach kodujących białka synaptyczne. Opisaliśmy tutaj technikę sekcji, która umożliwia dostęp do złączy nerwowo-mięśniowych (NMJ) C. elegans w celu analizy elektrofizjologicznej. Towarzyszące wideo przedstawia kluczowe etapy sekcji C. elegans oraz typową konfigurację rejestracji stosowaną do pomiaru aktywności synaptycznej. Trzy kroki, które stanowią największe wyzwanie podczas na...