Infekcja wirusem vaccinia oraz analiza czasowa ekspresji genów wirusa: Część 1

Podsumowanie

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 1 z 3.

Streszczenie

RodzinaPoxviridaeskłada się z dużych dwuniciowych cząsteczek DNA zawierających wirusy, które replikują się wyłącznie w cytoplazmie zainfekowanych komórek. Przedstawiciele tejorthopoxrodzaj obejmuje variola, czynnik etiologiczny ospy prawdziwej u ludzi, monkeypox oraz vaccinia (VAC), prototypowego przedstawiciela rodziny wirusów. W obrębie stosunkowo dużego (~ 200 kb) genomu vaccinia kodowane są trzy klasy genów: wczesne, pośrednie i późne. Choć wszystkie trzy klasy są transkrybowane przez kodowane wirusowo polimerazy RNA, każda z nich pełni inną funkcję w cyklu życiowym wirusa. Poxwirusy stosują wiele strategii modulacji środowiska komórkowego gospodarza podczas infekcji. Aby zrozumieć regulację ekspresji genów zarówno gospodarza, jak i wirusa, zastosowaliśmy podejścia całogenomowe do analizy obfitości transkryptów z komórek wirusa i gospodarza. W niniejszym materiale demonstramosmy przebieg infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz pobieranie RNA w kilku punktach czasowych po infekcji. Całkowite RNA gospodarza i wirusa jest izolowane i amplifikowane w celu hybrydyzacji z macierzami mikroarray do analizy ekspresji genów.

Protokół

Część 1: Przygotowanie zakażenia

1. Hodować komórki HeLa w kolbach i czekać, aż osiągną konfluencję na poziomie około 80%.
2. Przygotować odpowiednią ilość pożywki do wzrostu wirusa na potrzeby eksperymentu: standardowe DMEM z 2% FBS bez dodatku antybiotyków.
3. Infekcję można przeprowadzić, używając albo surowego stoku wirusa vaccinia o znanym mianie, albo wirusa oczyszczonego sacharozą o znanym mianie, jeśli istotna jest kwestia ekspresji genów gospodarza.
4. W przypadku użycia wirusa oczyszczonego sacharozą należy przejść bezpośrednio do części 2.
5. W przypadku użycia surowego stoku wirusa vaccinia, bezpośrednio przed infekcją, poddać alikwot wirusa działaniu sonikatora kubkowego w kąpieli składającej się głównie z lodu i niewielkiej ilości wody.
   • Sonikować przy mocy około 30W przez 20 sekund.
   • Wymieszać zawartość probówki w wirówce typu vortex i powtórzyć sonikację 3 razy, dodając w razie potrzeby więcej lodu, aby utrzymać kubek wypełniony lodem i schłodzony.
   • Mieszać w vortexie pomiędzy każdym etapem sonikacji.
   • Przejść do części 2.
6. Alternatywnie, w przypadku braku sonikatora kubkowego, zmieszać równą objętość surowego stoku wirusa i trypsyny w stężeniu 0.25mg/mL.
   • Wymieszać energicznie w vortexie.
   • Inkubować mieszaninę stoku wirusa i trypsyny w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 30 minut.
   • Mieszać w vortexie w odstępach 5-10 minut.
   • Przejść do części 2.

Część 2: Infekowanie komórek

1. Oblicz ilość cząsteczek wirusa potrzebną do zainfekowania monowarstwy przy pożądanej wielokrotności infekcji (MOI). Zazwyczaj do przebiegu czasowego infekcji stosuje się wysoką wartość MOI (między 5 a 10).
2. Dodaj pożądaną ilość wirusa oczyszczonego sacharozą lub surowego wirusa poddanego trypsynizacji do pożywki do wzrostu wirusa o temperaturze 37°C i dobrze wymieszaj. Należy użyć takiej ilości pożywki, aby zaledwie pokryła dno kolby. Na przykład 10 mL pożywki dla kolby T-175.
3. Usuń pożywkę z komórek i wypłucz je PBS w temperaturze pokojowej.
4. Dodaj wirusa w pożywce do wzrostu wirusa do każdej kolby.
   • Delikatnie zamieszaj, przechyl płytki i inkubuj w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 przez 1 godzinę.
   • Przechylaj i zamieszaj płytki co 15 minut, aby równomiernie rozprowadzić wirusa i utrzymać komórki w stanie wilgotnym.
   • Dla punktu czasowego 0 h/kontrolnego (Mock), dodaj samą pożywkę do wzrostu wirusa, bez dodatku wirusa.
5. Po 1-godzinnej inkubacji usuń pożywkę zawierającą wirusa i wypłucz trzy razy PBS w temperaturze pokojowej.
6. Dodaj maksymalną ilość pożywki do wzrostu wirusa do każdej kolby. Na przykład 30 mL pożywki dla kolby T-175. Przyjmij ten moment jako punkt czasowy 0 h.

Część 3: Pozyskiwanie komórek

1. Obejrzeć komórki pod mikroskopem i odnotować wszelki efekt cytopatyczny (CPE).
2. Usunąć medium i wypłukać komórki 30 mL PBS o temperaturze pokojowej.
3. Dodać do komórek 15 mL trypsyny i inkubować przez 2-5 min w temperaturze 37°C.
4. Sprawdzić pod mikroskopem odłączenie się komórek i delikatnie opukać kolbę, aby oderwać komórki.
5. Przenieść komórki za pomocą sterylnej pipety serologicznej do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
6. Przepłukać kolbę równą objętością medium wzrostowego, a następnie dodać to medium do trypsynizowanych komórek w probówce stożkowej.
7. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
8. Usunąć trypsynę/medium znad osadu komórkowego.
9. Resuspender osad komórkowy w odczynniku TRIzol lub buforze lizującym z wybranego zestawu do izolacji RNA.
10. W przypadku użycia TRIzolu, podzielić próbkę na alikwoty po 1 mL w opisanych probówkach Eppendorf 1,5 mL i zamrozić w temperaturze -80°C.
11. Powtórzyć procedurę dla wszystkich punktów czasowych, zbierając jedną kolbę dla każdego punktu czasowego.

Część 4: Ekstrakcja RNA z próbek w TRIzol

1. Na tym etapie próbki powinny być resuspenderowane w odczynniku TRIzol i gotowe do dalszej obróbki.
2. Do każdej probówki dodaj 200µL odczynnika do separacji faz BCP na każdy 1 mL TRIzol. W przypadku rozpoczęcia pracy z dużą ilością TRIzol może być konieczne przeniesienie próbki do większej probówki.
3. Wymieszaj intensywnie za pomocą wortexa lub wstrząsając i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty.
4. Odwirowuj próbkę przy 12,000 x g przez 15 minut.
5. Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Faza wodna to przejrzysta warstwa na górze. Powinieneś odzyskać około 600µL na każdy 1mL TRIzol użyty na początku.
6. Przeprowadź drugą ekstrakcję fenol-chloroformową, tym razem stosując 500µL chloroformu na 1 ml TRIzol zamiast BCP.
7. Wymieszaj intensywnie za pomocą wortexa lub wstrząsając i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty.
8. Odwirowuj próbkę przy 12,000 x g przez 15 minut.
9. Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Faza wodna to przejrzysta warstwa na górze.
10. Do każdej próbki dodaj 20µg liniowej akrylamidu. Liniowy akrylamid działa jako nośnik i pomaga w wytrącaniu RNA.
11. Do każdej próbki dodaj 500µL izopropanolu na każdy 1 ml TRIzol użyty na początku i dokładnie wymieszaj.
12. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
13. Odwirowuj w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 10-15 minut.
14. Osad RNA będzie widoczny na dnie probówki. Bardzo ostrożnie usuń nadsącz z probówki, używając aspiratora próżniowego lub pipety. Nie naruszaj osadu.
15. Przemyj osad 1 mL 70% etanolu.
    • Dodaj 1 mL 70% etanolu do osadu.
    • Odwirowuj z maksymalną prędkością 14,000g przez 5-7 minut.
    • Bardzo ostrożnie usuń etanol z probówki za pomocą aspiratora próżniowego lub pipety. Upewnij się, że osad jest widoczny na dnie probówki.
    • Odrzuć nadsącz.
16. Powtórz etap przemywania. Po usunięciu nadsączu zaznacz na probówce miejsce, w którym znajduje się osad.
17. Susz osad na powietrzu nie dłużej niż przez 5 minut. Nie wysusz go zbyt mocno, w przeciwnym razie RNA będzie trudne do resuspensji!
18. Jeśli chcesz przeprowadzić opcjonalne traktowanie DNazą w celu usunięcia pozostałego DNA z próbki, resuspenderuj osad w 17µL wody wolnej od nukleaz. W przeciwnym razie resuspenderuj osad w 20µL wody wolnej od nukleaz i przejdź do kroku 22.
19. (Opcjonalne traktowanie DNazą) Korzystając z zestawu DNazy wolnej od RNazy firmy Qiagen, dodaj 2µL buforu RDD i 1µL zrekonstytuowanej DNazy I wolnej od RNazy do resuspenderowanego RNA. Wymieszaj delikatnie.
20. (Opcjonalne traktowanie DNazą) Inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 minut.
21. (Opcjonalne traktowanie DNazą) Dodaj 2µL 2,5 mM EDTA i inkubuj w temperaturze 65°C przez 5 minut, aby inaktywować DNazę. Nie przekraczaj czasu ani temperatury inaktywacji, ponieważ dłuższy czas lub wyższa temperatura mogą spowodować degradację RNA.
22. Sprawdź stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
23. Przechowuj próbkę RNA w temperaturze -80°C.
24. (Opcjonalna kontrola jakości) Sprawdź jakość RNA za pomocą Agilent BioAnalyzer lub poprzez rozdzielenie próbki na żelu denaturującym i sprawdzenie odczytów O.D. (260nm oraz stosunku 260/280).

Dyskusja

Kluczowe etapy

Część 1 i 2

Istnieje kilka krytycznych etapów przygotowania synchronicznej infekcji wirusem vaccinia, z których pierwszym jest staranna sonikacja (lub trypsynizacja) wirusa w celu rozbicia agregatów cząstek wirusowych. Wirus vaccinia ma silną tendencję do agregacji, a rozproszenie cząstek wirusowych jest istotne dla zapewnienia równomiernej infekcji komórek. Aby uzyskać synchroniczną infekcję, należy zastosować wysoką wielokrotność infekcji (MOI powyżej ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik TRIzol	Odczynnik	Invitrogen	15596-026	Można również zastosować podobne odczynniki, takie jak TriPure firmy Roche.
Odczynnik do separacji faz BCP	Odczynnik	Molecular Research Center	BP151
Zestaw DNazy wolnej od RNaz	Odczynnik	Qiagen	79254	Obróbka DNazą jest krokiem opcjonalnym.