Stomatogastryczny układ nerwowy (STNS) kraba Jonah (C. borealis) może być wykorzystywany w badaniach z zakresu elektrofizjologii, immunohistochemii oraz hodowli komórkowych. Ekstrakcja STNS odbywa się w dwóch etapach: preparacji wstępnej oraz precyzyjnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego Cancer Borealis
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwoj stomatogastryczny (STG) stanowi doskonały model do badania interakcji komórkowych i sieciowych, ponieważ składa się z relatywnie niewielkiej liczby komórek (około 25 u C. borealis), które są dobrze scharakteryzowane. Komórki w STG wykazują szeroki zakres sygnałów wyjściowych i odpowiadają za czynności motoryczne żołądka. Żołądek zawiera młyn żołądkowy, który rozdrabnia pokarm za pomocą trzech wewnętrznych zębów, oraz odźwiernik, który filtruje pokarm przed jego przedostaniem się do jelita środkowego. STG generuje dwa rytmiczne sygnały wyjściowe sterujące młynem żołądkowym i odźwiernikiem, znane jako centralne generatory wzorców (CPG). Każda komórka w STG może uczestniczyć w jednym lub obu tych rytmach. CPG umożliwiają badanie neuromodulacji, homeostazy, zmienności komórkowej i sieciowej, rozwoju sieci oraz regeneracji sieci.
Disekcję stomatogastrycznego układu nerwowego (STNS) kraba borealis (Cancer borealis) przeprowadza się w dwóch etapach: dyssekcji ogólnej oraz precyzyjnej. Podczas dyssekcji ogólnej z kraba wycina się cały żołądek. W trakcie dyssekcji precyzyjnej STNS jest wyodrębniany z żołądka przy użyciu mikroskopu stereoskopowego oraz narzędzi do mikrodyssekcji (patrz ryc. 1). STNS obejmuje STG, zwoj przełykowy (OG) oraz zwoje komisuralne (CoG), a także nerwy unerwiające mięśnie żołądka. W niniejszej procedurze pokazujemy, jak przeprowadzić pełną dyssekcję STNS w celu przygotowania do eksperymentu elektrofizjologicznego, w którym rejestrowana będzie aktywność wewnątrzkomórkowa komórek STG, a nerwy obwodowe posłużą do rejestracji zewnątrzkomórkowej. Przedstawiono właściwą technikę lokalizacji poszczególnych nerwów oraz metodę usuwania osłonki zwoju w celu odsłonięcia somat i neuropila.
Protokół
1. Sekcja makroskopowa
- Umieść kraba na lodzie na 30 minut, aby otępić systemy sensoryczne i motoryczne zwierzęcia. Otocz go lodem z każdej strony. Podczas pracy z krabem należy nosić rękawice.
- Przygotuj się do sekcji makroskopowej, rozkładając kuwetę sekcyjną oraz narzędzia, których będziesz używać. Potrzebne będą kleszczyki rongeury, nożyce do kości, małe nożyce, pęseta ząbkowana, szpatułka z zaostrzonym brzegiem, czarna szalka powlekana Sylgardem oraz szpilki entomologiczne.
- Wyjmij kraba z wiadra z lodem, chwytając go za tylną odnóżkę, aby zapobiec uszczypnięciu, i umieść go w kuwecie sekcyjnej.
- Usuń najpierw szczypce, skręc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Disekcja STNS jest pierwszym krokiem w przeprowadzaniu eksperymentu z zakresu elektrofizjologii lub immunohistochemii, a także w pozyskiwaniu komórek do hodowli komórkowych. Niezależnie od planowanego eksperymentu, dyssekcja makroskopowa pozostaje bez zmian, natomiast dyssekcja precyzyjna może się różnić. Ważne jest, aby z wyprzedzeniem zaplanować, z których komórek i nerwów będą pobierane pomiary. Większość neuronów w STG posiada wypustki unerwiające przynajmniej jeden mięsień w żołądku (patrz ryc. 2) i są one klasyfiko.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Wyrażamy wdzięczność członkom laboratorium Marder. Dziękujemy naszej mentorce, dr Eve Marder, za wsparcie i zachętę. Badania te były finansowane z grantów NS-17813 oraz NS-058110 przyznanych przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Czarny Sylgard 170 | Inne | Dow Corning | 170 | Sekcja makroskopowa |
| Nożyczki precyzyjne | Chirurgia | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Szpilki entomologiczne rozmiar 6 | Chirurgia | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Nożyczki Mayo | Chirurgia | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Mikroszpatułka | Chirurgia | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Kuszczyki | Chirurgia | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Pinceta tkankowa | Chirurgia | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Cienki drut wolframowy (średnica 0.001 in.) | Chirurgia | California Fine Wire Company | Sekcja precyzyjna | |
| Pinceta nr 5 | Chirurgia | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Szpilki Minuten | Chirurgia | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Nożyczki sprężynowe Moria (ostrza 7 mm) | Chirurgia | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Szkło Petriego (100x15 mm) | Inne | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Uchwyt do szpilek | Chirurgia | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Pinceta super precyzyjna nr 5SF | Chirurgia | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Inne | Dow Corning | 182 | |
| Igły wolframowe | Chirurgia | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Mikroskop sekcyjny | Mikroskop | Wild | MC3 | Różne |
| Krab borealis (C. borealis) | Zwierzę | Commercial Lobster |
Bibliografia
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
