Stomatogastryczny układ nerwowy (STNS) kraba Jonah (C. borealis) może być wykorzystywany w badaniach z zakresu elektrofizjologii, immunohistochemii oraz hodowli komórkowych. Ekstrakcja STNS odbywa się w dwóch etapach: preparacji wstępnej oraz precyzyjnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Disekcja układu nerwowego stomatogastrycznego Cancer Borealis
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwoj stomatogastryczny (STG) stanowi doskonały model do badania interakcji komórkowych i sieciowych, ponieważ składa się z relatywnie niewielkiej liczby komórek (około 25 u C. borealis), które są dobrze scharakteryzowane. Komórki w STG wykazują szeroki zakres sygnałów wyjściowych i odpowiadają za czynności motoryczne żołądka. Żołądek zawiera młyn żołądkowy, który rozdrabnia pokarm za pomocą trzech wewnętrznych zębów, oraz odźwiernik, który filtruje pokarm przed jego przedostaniem się do jelita środkowego. STG generuje dwa rytmiczne sygnały wyjściowe sterujące młynem żołądkowym i odźwiernikiem, znane jako centralne generatory wzorców (CPG). Każda komórka w STG może uczestniczyć w jednym lub obu tych rytmach. CPG umożliwiają badanie neuromodulacji, homeostazy, zmienności komórkowej i sieciowej, rozwoju sieci oraz regeneracji sieci.
Disekcję stomatogastrycznego układu nerwowego (STNS) kraba borealis (Cancer borealis) przeprowadza się w dwóch etapach: dyssekcji ogólnej oraz precyzyjnej. Podczas dyssekcji ogólnej z kraba wycina się cały żołądek. W trakcie dyssekcji precyzyjnej STNS jest wyodrębniany z żołądka przy użyciu mikroskopu stereoskopowego oraz narzędzi do mikrodyssekcji (patrz ryc. 1). STNS obejmuje STG, zwoj przełykowy (OG) oraz zwoje komisuralne (CoG), a także nerwy unerwiające mięśnie żołądka. W niniejszej procedurze pokazujemy, jak przeprowadzić pełną dyssekcję STNS w celu przygotowania do eksperymentu elektrofizjologicznego, w którym rejestrowana będzie aktywność wewnątrzkomórkowa komórek STG, a nerwy obwodowe posłużą do rejestracji zewnątrzkomórkowej. Przedstawiono właściwą technikę lokalizacji poszczególnych nerwów oraz metodę usuwania osłonki zwoju w celu odsłonięcia somat i neuropila.
Protokół
1. Sekcja makroskopowa
- Umieść kraba na lodzie na 30 minut, aby otępić systemy sensoryczne i motoryczne zwierzęcia. Otocz go lodem z każdej strony. Podczas pracy z krabem należy nosić rękawice.
- Przygotuj się do sekcji makroskopowej, rozkładając kuwetę sekcyjną oraz narzędzia, których będziesz używać. Potrzebne będą kleszczyki rongeury, nożyce do kości, małe nożyce, pęseta ząbkowana, szpatułka z zaostrzonym brzegiem, czarna szalka powlekana Sylgardem oraz szpilki entomologiczne.
- Wyjmij kraba z wiadra z lodem, chwytając go za tylną odnóżkę, aby zapobiec uszczypnięciu, i umieść go w kuwecie sekcyjnej.
- Usuń najpierw szczypce, skręcając każde z nich do wewnątrz. Następnie usuń każdą odnóżkę, stosując ten sam ruch obrotowy.
- Za pomocą kleszczyków rongeury usuń szczękę (maxilla) zakrywającą otwory gębowe. Usuń również miękką przedszczękę (maxillule).
- Ponownie używając kleszczyków rongeury, zacznij od bocznego tylnego końca pancerza i mocno chwyć jego krawędź. Zaciśnij kleszczyki i odłam ten fragment pancerza. Upewnij się, że usunięto wystarczająco dużo pancerza, aby szpatułka mogła dostać się do otworu. Kontynuuj usuwanie krawędzi pancerza aż do oczu i powtórz czynność po drugiej stronie.
- Zaostrzoną stroną szpatułki delikatnie zeskrob miękką tkankę wewnętrzną z dachu grzbietowego pancerza. Trzymaj szpatułkę w kontakcie z pancerzem, aby uniknąć uszkodzenia STNS. Użyj kleszczyków rongeury, aby odłamać części pancerza, które zostały oddzielone od tkanki. Oddziel również część miękkiej tkanki od brzusznej części pancerza, pamiętając o oddzieleniu wszelkich mięśni przywodzicieli łączących tkankę z pancerzem.
- Odłam pancerz grzbietowy tak daleko w stronę tylną, aż do serca, gdzie z pancerza wystają dwie małe kostki. Tnij tak daleko w stronę przednią, jak to możliwe. Stabilizuj cefalon („twarz”) jednym palcem podczas odłamywania najbardziej przednich części pancerza grzbietowego.
- Na brzusznej stronie pancerza wyciągnij żuwaczki jedna po drugiej, opierając kleszczyki rongeury o żuwaczkę, skręcając je na zewnątrz, aby oderwać żuwaczkę od przymocowanego epistomum i odciągając ją. Jeśli czynność została wykonana prawidłowo, do wyciągniętej żuwaczki powinny być przytwierdzone dwie długie kostki z mięśniami.
- Oddziel tkankę z boków cefalonu w pobliżu oczu za pomocą szpatułki. Małymi nożycami sekcyjnymi przetnij tkankę tak blisko grzebienia kostnego, jak to możliwe, warstwa po warstwie.
- Oprzyj kraba o ściankę kuwety sekcyjnej i podeprzyj go, aby go unieruchomić (do tego celu można wykorzystać szczypce). Odetnij labrum („przednią wargę”) od epistomum, upewniając się, że nie pozostała żadna przytwierdzona tkanka. Używając nożyc do kości, wykonaj dwa skośne cięcia w brzusznej części pancerza, aby usunąć cefalon.
- Chwyć labrum pęsetą ząbkowaną i odetnij labium („tylną wargę”) od kostki po stronie brzusznej. Następnie delikatnie unieś wargę od pozostałej części brzusznego pancerza. Użyj małych nożyc, aby oddzielić brzuszną część żołądka od tkanki wyściełającej pancerz. Gdy ampulle pyloryczne staną się widoczne, odetnij żołądek od tkanki po obu jego stronach, aż żołądek zostanie wyjęty z kraba.
- Wciąż trzymając żołądek za wargę pęsetą, oprzyj go o dłoń i wlej sól fizjologiczną do otworu gębowego. Powoduje to rozszerzenie żołądka i ułatwia jego rozcięcie. Przetnij od otworu gębowego w dół pomiędzy pylorus, bezpośrednio przez kostkę między ampullami. Następnie przetnij ukośnie w dół przez dwa odgałęzienia kardialne. Odetnij wierzchołki trzech zębów wewnątrz żołądka.
- Umieść żołądek na dużej, czarnej szalce powlekanej Sylgardem wnętrzem żołądka do dołu. Przytwierdź pięć rogów preparatu szpilkami entomologicznymi i wypełnij szalkę zimną solą fizjologiczną, zanurzając cały preparat (patrz ryc. 1).
2. Precyzyjna sekcja
- Do precyzyjnej dysekcji niezbędne są narzędzia do mikrodysekcji. W szczególności wymagane są pęsety i nożyczki sprężynowe, a także uchwyt do pinezek z igłą wolframową. Należy przygotować również przezroczystą szalkę Petriego pokrytą Sylgardem oraz kilka cienkich drucianych pinezek.
- Zacznij od najmniejszego powiększenia, przypinając płaty w pobliżu warg w miejscu, gdzie znajdował się otwór gębowy. Przesuń pozostałe szpilki tak, aby preparat był napięty, i przypnij wszystkie inne niezbędne obszary.
- Ostrożnie unieś nakrapianą skórę podskórną pokrywającą dolną część preparatu i przytnij ją poprzecznie, pozostawiając fragment skóry podskórnej z dwiema białymi kropkami.
- Odsłoń żółtą, włóknistą tkankę błoniastą znajdującą się w dolnej części preparatu. mvns są słabo przytwierdzone do dolnej powierzchni tej tkanki. Ostrożnie oddzielić mvns z żółtej tkanki w miarę jej podciągania. Śledź żółtą tkankę ku górze i wykonaj cięcie wzdłuż mózgu.
- Podążaj za grubymi wypustkami wychodzącymi z mózgu i rozchodzącymi się bocznie. Są to nerwy komisuralne. Po dotarciu do końca nerwu komisuralnego usuń masę gąbczastej, białawej tkanki, która została odcięta z boku mózgu.
- Gdzie jony i synowie znajdź CoGs, odetnij mięśnie i tkankę, aby odsłonić długość jony i synowie.
- Powróć do zaznaczonego fragmentu skóry właściwej i wycięcie go. Powinno to pozostawić otwór w tętnicy otaczającej STG. Przetnij otwór, aby rozdzielić dwa mięśnie flankujące STG. Unieś końce tych mięśni i przetnij obszar bezpośrednio pod nimi, aby oddzielić je od tętnicy i odsłonić alns i aktywne jądra galaktykOddziel mięśnie flankowe tak wysoko, jak to możliwe, aż do chrząstki znajdującej się nad stn.
- Wyciąć tkankę tętniczą otaczającą STG do miejsca, w którym mvns, dgn, i dvn spotkać się. Przesuwać się w dół wzdłuż dvn w kierunku lvns i przeciąć białawą, delikatną tkankę pokrywającą lvns.
- Zlokalizuj psn nad kosteczką słuchową w dolnej części preparatu. Psn można wykorzystać do zlokalizowania lvn i dlvn złącze
- Następnie postępuj zgodnie z dlvn w dół, aby zlokalizować pyn i pdnPrzewód często owija się wokół ampuły odźwiernika w kierunku otworu. pdn odgałęzia się od dlvn i znajduje się pomiędzy ampułą odźwiernika a mięśniami zastawki kardio-pylorycznej. Pozostaw część mięśnia przytwierdzoną do jednego z tych nerwów, ponieważ można je łatwo pomylić podczas przenoszenia preparatu do przezroczystej szalki z Sylgardu.
- Po odsłonięciu wszystkich nerwów należy przeciąć wszelkie pozostałe połączenia między STNS a tkanką oraz niepożądanymi nerwami żołądka. Ostrożnie odsunąć STNS od pozostałej części żołądka, przecinając wszelkie pominięte połączenia.
- Przygotuj przezroczystą szalkę z Sylgardu, pocierając jej powierzchnię pozostałą masą tkanki żołądka, aż powierzchnia Sylgardu przestanie być zbyt lepka lub sucha. Sylgard jest hydrofobowy i w przypadku braku przygotowania szalki w ten sposób, STNS będą silnie do niego przylegać.
- Dodaj do szalki niewielką ilość zimnego roztworu soli fizjologicznej. Chwyć pęsetą górne końce nerwów komisuralnych i przenieś STNS do przezroczystej szalki z Sylgardu.
- Przymocuj STNS do Sylgardu. Oddziel mózg od nerwów komisuralnych, a następnie za pomocą pinów minuten najpierw unieruchom cztery końce CoG. Upewnij się, że preparat jest skierowany stroną górną do góry, sprawdzając, czy ivn jest skierowany w górę, z dala od Sylgardu. dgn powinno wychodzić nieco poniżej STG, gdy STG znajduje się w pozycji prawidłowej. Pozostałe końce nerwu przypnij za pomocą cienkich pinów drucianych.
- Usuń wszelkie pozostałości mięśni lub tkanki z STNS.
- Zdejmij osłonkę z STG, używając uchwytu do pinezek oraz lekko zagiętej, cienkiej igły wolframowej. Wykonaj mały otwór w narożniku osłonki STG, z dala od ciał komórek, i wykorzystaj go, aby przedostać się między warstwy osłonki. Ostrożnie wytnij płat oddzielonej osłonki, aby odsłonić neuropil i ciała komórek STG.
- Przypnij wszelkie klapy osłonki, aby zwiększyć dostęp do ciał komórkowych oraz ustabilizować STG do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Ponownie przypnij pozostałą część STNS, upewniając się, że każdy nerw jest napięty i odpowiednio rozmieszczony do rejestracji zewnątrzkomórkowej (patrz ryc. 3).
3. Wyniki
- W idealnym przypadku wszystkie nerwy powinny być wolne od nacięć i uszkodzeń, w szczególności te, z których będą pobierane zapisy. Żaden z nerwów nie powinien być zaplątany ani skręcony. STG powinno być nienaruszone, a wszystkie komórki powinny być rozmieszczone w formacji „brody” wokół neuropilu. Nienaruszony STNS jest symetryczny dwustronnie i przypomina homunkulusa, w którym lvns stanowią nogi, mvns ramiona, a koniec przedni głowę.
Skróty:
| STNS | Stomatogastryczny układ nerwowy |
| STG | Zwoj stomatogastryczny |
| Środek ciężkości | Zwoj komisuralny |
| OG | Zwoje przełykowe |
| mvn | Środkowy nerw komorowy |
| jon | Dolny nerw przełykowy |
| syn | Górny nerw przełykowy |
| AGN | Przedni nerw żołądkowy |
| aln | Nerw boczny przedni |
| dgn | Grzbietowy nerw żołądkowy |
| dvn | Grzbietowy nerw komorowy |
| lvn | Nerw komory bocznej |
| psn | Tylny nerw żołądka |
| pyn | Nerw odźwiernikowy |
| pdn | Nerw rozszerzający odźwiernik |
| dlvn | Gałąź grzbietowa nerwu komory bocznej |
| ivn | Dolny nerw komorowy |
Rycina 1: Schemat ilustrujący przybliżone rozmieszczenie STNS w żołądku przed sekcją.
Rysunek 2: Schemat różnych mięśni w dolnej części żołądka oraz nałożona warstwa STNS w jasnozielonym kolorze. Każdy typ komórki w STG jest wymieniony wraz z mięśniami, które według stanu wiedzy unerwia. Mapa ta jest pomocna podczas planowania sekcji nerwu, który przenosi sygnał z danej komórki ( courtesy of the Nadim lab).
Rysunek 3: Schematyczny rysunek STNS z elektrodami wewnątrzkomórkowymi i studniami zewnątrzkomórkowymi (za Marder i Bucher, 2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Disekcja STNS jest pierwszym krokiem w przeprowadzaniu eksperymentu z zakresu elektrofizjologii lub immunohistochemii, a także w pozyskiwaniu komórek do hodowli komórkowych. Niezależnie od planowanego eksperymentu, dyssekcja makroskopowa pozostaje bez zmian, natomiast dyssekcja precyzyjna może się różnić. Ważne jest, aby z wyprzedzeniem zaplanować, z których komórek i nerwów będą pobierane pomiary. Większość neuronów w STG posiada wypustki unerwiające przynajmniej jeden mięsień w żołądku (patrz ryc. 2) i są one klasyfiko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Wyrażamy wdzięczność członkom laboratorium Marder. Dziękujemy naszej mentorce, dr Eve Marder, za wsparcie i zachętę. Badania te były finansowane z grantów NS-17813 oraz NS-058110 przyznanych przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Czarny Sylgard 170 | Inne | Dow Corning | 170 | Sekcja makroskopowa |
| Nożyczki precyzyjne | Chirurgia | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Szpilki entomologiczne rozmiar 6 | Chirurgia | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Nożyczki Mayo | Chirurgia | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Mikroszpatułka | Chirurgia | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Kuszczyki | Chirurgia | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Pinceta tkankowa | Chirurgia | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Cienki drut wolframowy (średnica 0.001 in.) | Chirurgia | California Fine Wire Company | Sekcja precyzyjna | |
| Pinceta nr 5 | Chirurgia | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Szpilki Minuten | Chirurgia | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Nożyczki sprężynowe Moria (ostrza 7 mm) | Chirurgia | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Szkło Petriego (100x15 mm) | Inne | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Uchwyt do szpilek | Chirurgia | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Pinceta super precyzyjna nr 5SF | Chirurgia | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Inne | Dow Corning | 182 | |
| Igły wolframowe | Chirurgia | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Mikroskop sekcyjny | Mikroskop | Wild | MC3 | Różne |
| Krab borealis (C. borealis) | Zwierzę | Commercial Lobster |
Bibliografia
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
