Iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego

Podsumowanie

Po uformowaniu się rurki neuralnej neuroepithelium ulega zwężeniu i fałdowaniu, podczas gdy rurka wypełnia się embrionalnym płynem mózgowo-rdzeniowym (eCSF), tworząc embrionalne komory mózgu. Opracowaliśmy tę technikę wstrzykiwania do komór, aby lepiej wizualizować wypełnioną płynem przestrzeń w kontraście do kształtu neuroepithelium w żywym embrionie.

Streszczenie

Prawidłowe formowanie się komór mózgu podczas embrionalnego rozwoju mózgu jest niezbędne dla jego prawidłowego funkcjonowania. Komory mózgu to wysoce konserwatywne jamie w obrębie mózgu, wypełnione płynem mózgowo-rdzeniowym. U danio pręgowanego, po formowaniu się cewy nerwowej, neuroepithelium przechodzi szereg zwężeń i fałdowań w miarę wypełniania się płynem, co prowadzi do powstania komór mózgu. Aby zrozumieć proces formowania się komór oraz towarzyszące mu zmiany kształtu neuroepithelium, opracowaliśmy metodę wizualizacji przestrzeni komorowej w porównaniu z tkanką mózgową. Jednak ze względu na przezroczystość embrionów danio pręgowanego, rozróżnienie tkanki od przestrzeni komorowej jest utrudnione. Opracowaliśmy zatem technikę wstrzykiwania do komór mózgu, w której przestrzeń komorowa jest wypełniana barwnikiem fluorescencyjnym, a następnie obrazowana za pomocą mikroskopii jasnopolowej i fluorescencyjnej. Obrazy jasnopolowe i fluorescencyjne są następnie przetwarzane i nakładane na siebie w programie Photoshop. Technika ta umożliwia wizualizację przestrzeni komorowej za pomocą barwnika fluorescencyjnego w odniesieniu do kształtu neuroepithelium widocznego na obrazie jasnopolowym. Wstrzykiwanie do komór mózgu u danio pręgowanego można stosować od 18 godziny po zapłodnieniu aż do wczesnych etapów larwalnych. Metoda ta była przez nas szeroko wykorzystywana w badaniach nad formowaniem się i morfogenezą komór mózgu, a także w charakterystyce mutantów morfogenezy mózgu (1-3).

Protokół

Protokół

Część 1: Przygotowanie do mikroiniekcji

1. Przygotuj się do wstrzyknięcia, wyciągając igły kapilarne za pomocą wyciągacza igieł firmy Sutter Instruments.
2. Napełnij igłę barwnikiem fluorescencyjnym (np. Texas-Red Dextran).
3. Zamocuj igłę w mikromanipulatorze i aparaturze do mikroiniekcji.
4. Odetnij igłę pod kątem do odpowiedniej wielkości, aby utworzyć ściętą końcówkę.
5. Zmierz wielkość kropli i upewnij się, że wynosi ona od 1-2nl na jedno wstrzyknięcie w oleju.

Część 2: Przygotowanie zarodków

1. Wykonaj wstrzyknięcia do zarodków na 30 minut przed osiągnięciem interesującego etapu rozwojowego. Na przykład, aby badać komory mózgu w 24 godzinach po zapłodnieniu (hpf), wykonaj wstrzyknięcia w 23,5 hpf. Etap rozwoju zarodków określ zgodnie z metodą Kimmel i wsp. (4).
2. Pod stereomikroskopem ostrożnie usuń chorion z zarodków, używając pęsety.
3. W plastikowej płytce pokrytej 1% agarozą wykonaj otwory za pomocą plastikowego końcowki do pipety 1-200 μl. Ostrożnie usuń korki z agarozy z wykonanych otworów pęsetą.
4. Przenieś zarodki w medium dla zarodków do płytki z agarozą z otworami.
5. Dodaj do medium tricainę (przygotowaną zgodnie z metodą Westerfield (5)), aby znieczulić zarodki i zapobiec ich ruchom podczas eksperymentu.
6. Delikatnie umieść zarodek ogonem w dół w otworze, orientując go tak, aby aparat do wstrzykiwania znajdował się po stronie tylnej zarodka.

Część 3: Iniekcja do komory mózgu

1. Aby wstrzyknąć barwnik do komór mózgu, odpowiednio ustaw zestaw do mikromanipulacji, tak aby końcówka igły znajdowała się w tym samym polu widzenia co embrion przy dużym powiększeniu.
2. Ostrożnie wprowadź igłę przez cienką płytkę dachową (roofplate) rombencephalonu, tuż za punktem przegięcia r0/r1, unikając uszkodzenia tkanki mózgowej znajdującej się poniżej.
3. Wstrzyknij niewielką ilość barwnika, wystarczającą do całkowitego wypełnienia komór. W zależności od stadium rozwoju embrionu, wypełnienie przestrzeni komorowej może wymagać kilku kolejnych wstrzyknięć.

Część 4: Obrazowanie

1. Używając czystej szalki powlekanej 1% agarozy, wykonaj w niej nowe otwory, usuń korki i dodaj trikainę, aby znieczulić zarodki i zapobiec ich poruszaniu się.
2. Wprowadź ogon zarodka z zastrzykiem do komory do otworu i ustaw go w pozycji do wykonania obrazu grzbietowego.
3. Wykonaj obraz przy użyciu światła przechodzącego.
4. Kluczowe jest, aby NIE PORUSZAĆ ZARODKA ANI MIKROSKOPU.
5. Zmień ustawienia mikroskopu i wykonaj obraz w świetle fluorescencyjnym.
6. Przestaw zarodek, aby wykonać obrazy boczne zarówno w świetle przechodzącym, jak i fluorescencyjnym.
7. Zapisz obrazy jako pliki TIFF w celu ich późniejszego przetwarzania w programie Photoshop.

Część 5: Przetwarzanie obrazów

1. Aby przetworzyć obrazy w programie Photoshop, otwórz obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym tego samego zarodka, wykonane w tej samej pozycji. Upewnij się, że wszystkie ustawienia są identyczne dla każdego obrazu.
2. Przeciągnij obraz fluorescencyjny na obraz w świetle przechodzącym i dokładnie je wyrównaj.
3. Przy zaznaczonym obrazie fluorescencyjnym wybierz „Obraz”, „Korekty”, a następnie „Zastąp kolor” i zmień czarne tło na białe.
4. W oknie „Zastąp kolor” dostosuj parametr „rozmycie” (fuzziness), przesuwając suwak w prawo, aż obrazy fluorescencyjne będą miały jednolity kolor.
5. W oknie „Warstwy” wybierz tryb „Mnożenie”, aby wyświetlić nałożone obrazy. Obraz przestrzeni komór powinien dokładnie pokrywać się z obrazem w świetle przechodzącym.
6. Zapisz ten plik i powtórz czynność dla pozostałych obrazów.

Reprezentatywne wyniki/efekty

Prawidłowe obrazy wstrzyknięcia do komory pokazano na rysunku 1, panele A-D, natomiast przykład nieprawidłowych obrazów wstrzyknięcia przedstawiono w panelach E-H. Prawidłowe wstrzyknięcia charakteryzują się ostrymi krawędziami i brakiem dyfuzji barwnika. Nieprawidłowe wstrzyknięcie, do którego dochodzi, gdy igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko do komory i uszkodzi tkankę mózgową poniżej, może skutkować widocznością barwnika poza przestrzenią komory oraz w żółtku.

Rycina 1. Iniekcje do komór mózgu embrionów typu dzikiego w 25 hpf. (A-D) Przedstawiono przykład prawidłowej metody iniekcji oraz (E-H) przykład nieprawidłowej metody iniekcji. (A,E) Grzbietowe obrazy w polu jasnym z odpowiadającymi im obrazami fluorescencyjnymi (B,F) oraz nałożeniem obrazów fluorescencyjnych i w polu jasnym (C,G) dla obu pokazanych metod iniekcji (prawidłowej i nieprawidłowej). Strzałki wskazują obszary, w których barwnik przedostał się poza przestrzeń komór mózgu z powodu nieprawidłowej iniekcji (patrz „Rozwiązywanie problemów”). Na wszystkich obrazach strona przednia znajduje się po lewej stronie.

Rozwiązywanie problemów:

Problem	Przyczyna	Lekarstwo
Zgniatają Państwo zarodek igłą.	Igła jest zbyt tępa lub jej końcówka jest zbyt duża.	Zacznij od użycia nowej igły i nie odłamaj jej zbyt daleko od nasady. Zaostrź końcówkę igły, aby uzyskać skos podobny do igły strzykawki.
Barwnik znajduje się w całym embrionie oraz żółtku (patrz Rys. 1E-H).	Igła przeszła przez tkankę i nie pozostała w przestrzeni komory.	Igła może być niewystarczająco ostra, co uniemożliwia kontrolowanie prędkości nakłucia.
Barwnik jest zbyt słaby lub nie znajduje się w przedmózgowiu.	Zastosowano zbyt niskie ciśnienie podczas wstrzykiwania lub igła nie została przesunięta wystarczająco daleko w kierunku przednim, aby dotrzeć do przedmózgowia podczas podawania barwnika.	Zwiększ ciśnienie wtrysku lub podczas wstrzykiwania wprowadź igłę nieco bardziej przednio. Jeśli wymagany jest większy poziom szczegółowości w przedmózgowiu, igłę można wprowadzić przez granicę między śródmózgowiem a rdzeniem przedłużonym. Można również po prostu odczekać chwilę, aż barwnik bardziej dyfunduje, przed przystąpieniem do obrazowania.
Obrazy fluorescencyjne są ciemne na krawędziach po wykonaniu zamiany kolorów w programie Photoshop.	Zapomniano zmienić ustawienie „rozmycia” (fuzziness) w oknie zamiany kolorów.	Przesuń suwak „rozmycia” (fuzziness) maksymalnie w prawo w oknie zastępowania kolorów.
Igła nie przebije płytki dachowej mózgu tylnego.	Igła nie została prawidłowo przycięta.	Przygotuj nową igłę. W przypadku wykonywania wielu iniekcji może być konieczne użycie kilku igieł, ponieważ mogą one stępić się podczas pracy.

Dyskusja

W tym filmie demonstrujemy, jak wstrzyknąć barwnik fluorescencyjny (dekstran Texas-Red) do rozwijających się komór mózgu rybki danio. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji przestrzeni komór mózgu w kontraście do otaczającego neuroepitelium i jest niezwykle użyteczna przy określaniu kształtu przestrzeni komorowej, jak również kształtu otaczającej tkanki mózgowej. Pozwala ona na lepsze zrozumienie procesu formowania się komór mózgu oraz morfogenezy mózgu w czasie w żywym embrionie. Technika ta stanowi doskonałe nar...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pinceta	Narzędzie	Fine Science Tools	11252-20
Rurki kapilarne (igły)	Narzędzia	Frederick Haer and Co.	30-30-1
Szalki powlekane agarozą	Narzędzia	Agaroza (Seakem GTG; Lonza) Szalki (Corning)	Agaroza (50027) Szalki (430166)	Przygotować warstwę agarozy o głębokości około 2-3 mm w szalce, w zależności od stadium zarodka, w który wykonuje się wstrzyknięcie
Mikroskop sekcyjny	Mikroskop	Carl Zeiss, Inc.
Kamera mikroskopowa z możliwością fluorescencji i oprogramowaniem do przechwytywania obrazu	Narzędzia
Końcówki do pipety 1-200 μ	Narzędzia	USA Scientific, Inc.	1111-0806	Mają one idealny rozmiar do wykonywania otworów w agarozie, w których zarodki mieszczą się idealnie.
Photoshop	Analiza obrazu	Adobe
Pętla do zarodków	Narzędzia			Wykonane samodzielnie z pipety szklanej i włosa lub żyłki wędkarskiej, uszczelnione woskiem pszczelim.
Mikrowtryskiwacz	Narzędzia	Harvard Apparatus	PL1-100
Wytciągacz igieł	Narzędzia	Sutter Instrument Co.		Ustawienia (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).
Mikromanipulator	Narzędzia	Narishige International
Barwnik fluorescencyjny Texas-Red Dextran 70,000MW	Odczynnik	Molecular Probes, Life Technologies	D1830	W razie potrzeby dostępne są inne masy cząsteczkowe.
Trykaina (estry etylowe kwasu 3-aminobenzoesowego)	Odczynnik	Sigma-Aldrich	A-5040
Poziomka do zarodków	Odczynnik			Zgodnie z Westerfield (5)