Po uformowaniu się rurki neuralnej neuroepithelium ulega zwężeniu i fałdowaniu, podczas gdy rurka wypełnia się embrionalnym płynem mózgowo-rdzeniowym (eCSF), tworząc embrionalne komory mózgu. Opracowaliśmy tę technikę wstrzykiwania do komór, aby lepiej wizualizować wypełnioną płynem przestrzeń w kontraście do kształtu neuroepithelium w żywym embrionie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Prawidłowe formowanie się komór mózgu podczas embrionalnego rozwoju mózgu jest niezbędne dla jego prawidłowego funkcjonowania. Komory mózgu to wysoce konserwatywne jamie w obrębie mózgu, wypełnione płynem mózgowo-rdzeniowym. U danio pręgowanego, po formowaniu się cewy nerwowej, neuroepithelium przechodzi szereg zwężeń i fałdowań w miarę wypełniania się płynem, co prowadzi do powstania komór mózgu. Aby zrozumieć proces formowania się komór oraz towarzyszące mu zmiany kształtu neuroepithelium, opracowaliśmy metodę wizualizacji przestrzeni komorowej w porównaniu z tkanką mózgową. Jednak ze względu na przezroczystość embrionów danio pręgowanego, rozróżnienie tkanki od przestrzeni komorowej jest utrudnione. Opracowaliśmy zatem technikę wstrzykiwania do komór mózgu, w której przestrzeń komorowa jest wypełniana barwnikiem fluorescencyjnym, a następnie obrazowana za pomocą mikroskopii jasnopolowej i fluorescencyjnej. Obrazy jasnopolowe i fluorescencyjne są następnie przetwarzane i nakładane na siebie w programie Photoshop. Technika ta umożliwia wizualizację przestrzeni komorowej za pomocą barwnika fluorescencyjnego w odniesieniu do kształtu neuroepithelium widocznego na obrazie jasnopolowym. Wstrzykiwanie do komór mózgu u danio pręgowanego można stosować od 18 godziny po zapłodnieniu aż do wczesnych etapów larwalnych. Metoda ta była przez nas szeroko wykorzystywana w badaniach nad formowaniem się i morfogenezą komór mózgu, a także w charakterystyce mutantów morfogenezy mózgu (1-3).
Protokół
Protokół
Część 1: Przygotowanie do mikroiniekcji
- Przygotuj się do wstrzyknięcia, wyciągając igły kapilarne za pomocą wyciągacza igieł firmy Sutter Instruments.
- Napełnij igłę barwnikiem fluorescencyjnym (np. Texas-Red Dextran).
- Zamocuj igłę w mikromanipulatorze i aparaturze do mikroiniekcji.
- Odetnij igłę pod kątem do odpowiedniej wielkości, aby utworzyć ściętą końcówkę.
- Zmierz wielkość kropli i upewnij się, że wynosi ona od 1-2nl na jedno wstrzyknięcie w oleju.
Część 2: Przygotowanie zarodków
- Wykonaj wstrzyknięcia do zarodków na 30 minut przed osią....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym filmie demonstrujemy, jak wstrzyknąć barwnik fluorescencyjny (dekstran Texas-Red) do rozwijających się komór mózgu rybki danio. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji przestrzeni komór mózgu w kontraście do otaczającego neuroepitelium i jest niezwykle użyteczna przy określaniu kształtu przestrzeni komorowej, jak również kształtu otaczającej tkanki mózgowej. Pozwala ona na lepsze zrozumienie procesu formowania się komór mózgu oraz morfogenezy mózgu w czasie w żywym embrionie. Technika ta stanowi doskonałe nar.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Laurze Anne Lowery, która opracowała tę technikę w laboratorium. HS jest wspierany przez grant NIHMH70926. Jennifer Gutzman otrzymała wsparcie w ramach stypendium podoktorskiego CSBi/Merck.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Pinceta | Narzędzie | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Rurki kapilarne (igły) | Narzędzia | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Szalki powlekane agarozą | Narzędzia | Agaroza (Seakem GTG; Lonza) Szalki (Corning) | Agaroza (50027) Szalki (430166) | Przygotować warstwę agarozy o głębokości około 2-3 mm w szalce, w zależności od stadium zarodka, w który wykonuje się wstrzyknięcie |
| Mikroskop sekcyjny | Mikroskop | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Kamera mikroskopowa z możliwością fluorescencji i oprogramowaniem do przechwytywania obrazu | Narzędzia | |||
| Końcówki do pipety 1-200 μ | Narzędzia | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | Mają one idealny rozmiar do wykonywania otworów w agarozie, w których zarodki mieszczą się idealnie. |
| Photoshop | Analiza obrazu | Adobe | ||
| Pętla do zarodków | Narzędzia | Wykonane samodzielnie z pipety szklanej i włosa lub żyłki wędkarskiej, uszczelnione woskiem pszczelim. | ||
| Mikrowtryskiwacz | Narzędzia | Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Wytciągacz igieł | Narzędzia | Sutter Instrument Co. | Ustawienia (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Mikromanipulator | Narzędzia | Narishige International | ||
| Barwnik fluorescencyjny Texas-Red Dextran 70,000MW | Odczynnik | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | W razie potrzeby dostępne są inne masy cząsteczkowe. |
| Trykaina (estry etylowe kwasu 3-aminobenzoesowego) | Odczynnik | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Poziomka do zarodków | Odczynnik | Zgodnie z Westerfield (5) |
Bibliografia
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
