$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Protokół
Część 1: Przygotowanie do mikroiniekcji
- Przygotuj się do wstrzyknięcia, pociągając za igły kapilarne za pomocą ściągacza igieł Sutter Instruments.
- Napełnij igłę barwnikiem fluorescencyjnym (takim jak Texas-Red Dextran).
- Zamontuj igłę w mikromanipulatorze i aparacie do mikroiniekcji.
- Przytnij igłę do odpowiedniego rozmiaru pod kątem, aby uzyskać ściętą końcówkę.
- Zmierz wielkość kropli i sprawdź, czy wynosi ona od 1 do 2 NL na wstrzyknięcie oleju.
Część 2: Przygotowanie zarodków
- Zarodki należy wstrzyknąć 30 minut przed etapem zainteresowania. Na przykład, aby zbadać komory w 24 godziny po zapłodnieniu (hpf), wstrzyknij zarodki w 23,5 hpf. Etap zarodków według Kimmela i wsp. (4).
- Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie usuń kosmówkę z zarodków za pomocą kleszczy.
- Używając plastikowego naczynia pokrytego 1% agarozą, zrób w agarozie plastikową końcówką do pipety o pojemności 1-200 μl. Ostrożnie wyjmij zatyczki agarozowe z otworów za pomocą kleszczy.
- Przenieś zarodki w pożywce zarodkowej do naczynia z agarozą z otworami.
- Dodać trikainę (wyprodukowaną zgodnie z Westerfieldem (5)) do pożywki, aby znieczulić zarodki i zapobiec ruchowi podczas eksperymentu.
- Delikatnie umieść ogon zarodka w dół w otworze i ustaw go tak, aby aparat do wstrzykiwań znajdował się po tylnej stronie zarodka.
Część 3: Wstrzykiwanie komory mózgowej
- Aby wstrzyknąć komorę mózgu, należy ustawić zestaw do mikromanipulacji tak, aby końcówka igły znajdowała się w tym samym polu widzenia, co zarodek przy dużej mocy.
- Ostrożnie przełóż igłę przez cienką płytkę dachową tyłomózgowia tuż za punktem zawiasu r0/r1, nie uderzając w tkankę mózgową poniżej.
- Wstrzyknij tylko tyle barwnika, aby całkowicie wypełnić komory. Wypełnienie przestrzeni komory może wymagać kilku wstrzyknięć, w zależności od stadium zarodka.
Część 4: Obrazowanie
- Używając czystego naczynia pokrytego 1% agarozą, zrób nowe otwory w naczyniu, usuń zatyczki i dodaj trikainę, aby znieczulić zarodki i zapobiec ruchowi.
- Umieść ogon zarodka, któremu wstrzyknięto komorę, w otworze i ustaw tak, aby uzyskać obraz grzbietowy.
- Zrób zdjęcie w świetle przechodzącym.
- Bardzo ważne jest, aby NIE RUSZAĆ ZARODKA ANI MIKROSKOPU.
- Zmień ustawienia mikroskopu i zrób zdjęcie w świetle fluorescencyjnym.
- Zmień położenie zarodka, aby wykonać zdjęcia boczne zarówno w świetle przechodzącym, jak i fluorescencyjnym.
- Zapisz obrazy jako pliki TIFF do przetwarzania obrazu w programie Photoshop.
Część 5: Przetwarzanie obrazu
- Aby przetworzyć obrazy w Photoshopie, otwórz obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym tego samego zarodka wykonane w tej samej pozycji. Upewnij się, że wszystkie ustawienia są takie same dla każdego obrazu.
- Przeciągnij obraz fluorescencyjny na obraz w świetle przechodzącym i dokładnie je wyrównaj.
- Po wybraniu obrazu fluorescencyjnego wybierz "Obraz", "Korekty", a następnie "Zamień kolor" i zmień czarne tło na białe.
- W oknie "Zamień kolor" ustaw współczynnik "rozmycia" w prawo, aż obrazy fluorescencyjne będą miały jednolity kolor.
- W oknie "Warstwy" wybierz "Mnożenie", aby wyświetlić obrazy nakładki. Twój obraz przestrzeni komorowej powinien dokładnie pasować do obrazu w świetle przechodzącym.
- Zapisz ten plik i powtórz tę czynność dla wszystkich innych obrazów.
Reprezentatywne wyniki/Wynik
Prawidłowe obrazy iniekcji komór są pokazane na rysunku 1 panele A-D, podczas gdy przykład nieprawidłowych obrazów iniekcji są pokazane na E-H. Prawidłowe zastrzyki mają ostre krawędzie i niedyfuzyjny barwnik. Nieprawidłowe wstrzyknięcie, które występuje, gdy igła jest wprowadzana zbyt głęboko do komory i uderza w tkankę mózgową poniżej, może powodować barwnik, który jest widoczny na zewnątrz przestrzeni komory i w żółtku.
Rysunek 1. Iniekcje komorowe 25 zarodków hpf typu dzikiego. (A-D) Prawidłowa metoda wstrzykiwania i (E-H) nieprawidłowa metoda wstrzykiwania są pokazane jako przykłady. (A,E) Pokazano obrazy grzbietowego jasnego pola z odpowiadającymi im obrazami fluorescencyjnymi (B,F) oraz nakładaniem obrazów fluorescencyjnych i obrazów jasnego pola (C,G) zarówno dla prawidłowych, jak i nieprawidłowych metod wstrzykiwania. Strzałki wskazują obszary, w których barwnik wydostał się poza przestrzeń komory mózgu z powodu nieprawidłowego wstrzyknięcia komory (patrz "Rozwiązywanie problemów"). Przód jest po lewej stronie na wszystkich obrazach.
Rozwiązywanie problemów:
problem
przyczyna
remedium
Zgniatasz zarodek igłą.
Twoja igła jest zbyt lub końcówka jest zbyt duża.
Zacznij od nowej igły i nie łam jej tak daleko. Skoś igłę, aby była ostra jak igła strzykawki.
Barwnik znajduje się w całym zarodku i żółtku (patrz ryc. 1E-H).
Twoja igła przeszła przez tkankę i nie pozostała w przestrzeni komory.
Twoja igła może nie być wystarczająco ostra, więc nie jesteś w stanie kontrolować prędkości nakłucia.
Barwnik jest zbyt słaby lub nie ma go w przodomózgowiu.
Do wstrzyknięcia nie użyto wystarczająco wysokiego ciśnienia lub igła nie znajdowała się wystarczająco daleko do przodu, aby dotrzeć do przodomózgowia w momencie wstrzykiwania barwnika.
Podczas wstrzyknięcia należy zwiększyć ciśnienie iniekcji lub umieścić igłę nieco bardziej do przodu. Możesz wprowadzić igłę przez granicę śródmózgowia i tyłomózgowia, jeśli wymagane są więcej szczegółów w przodomózgowiu. Możesz też po prostu trochę poczekać, aż barwnik jeszcze bardziej się rozdyszy przed obrazowaniem.
Twoje obrazy fluorescencyjne są ciemne na krawędziach po zastąpieniu kolorów w Photoshopie.
Zapomniałeś zmienić ustawienie "rozmycie" w oknie zamiany kolorów.
Przesuń "rozmycie" maksymalnie w prawo w oknie zamiany kolorów.
Igła nie przebije tylnej płyty dachowej mózgu.
Twoja igła nie jest prawidłowo przycięta.
Zrób nową igłę. Jeśli robisz dużo zastrzyków, może być konieczne kilka igieł, ponieważ mogą one stać się matowe.