Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

Podsumowanie

Szczegółowe metody obrazowania Ca²⁺ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych organów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazu oraz analizę danych.

Streszczenie

Obrazowanie Ca²⁺ w mięśniach gładkich pozwala na wgląd w mechanizmy komórkowe, które mogą nie prowadzić do zmian potencjału błony, takie jak uwalnianie Ca²⁺ z wewnątrzkomórkowych magazynów, oraz umożliwia jednoczesne monitorowanie wielu komórek w celu oceny, na przykład, sprzężenia w tkance syncytialnej. Podkomórkowe przejściowe wzrosty stężenia Ca²⁺ są powszechne w mięśniach gładkich, jednak ich dokładny pomiar jest trudny ze względu na problemy wynikające z ich stochastycznego występowania, często w szerokim polu widzenia, w narządzie podatnym na skurcze. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy serię protokołów obrazowania i rutyn analizy w celu automatycznego pozyskiwania i analizowania częstotliwości, lokalizacji oraz amplitudy takich zdarzeń. Choć podejście to można zastosować w innych kontekstach, nasza praca koncentruje się na detekcji lokalnych purinergicznych przejściowych wzrostów stężenia Ca²⁺ w celu lokalizacji uwalniania przekaźnika z rozdzielczością submikronową.

ATP jest uwalniany jako kotransmiter z nerwów autonomicznych, gdzie wiąże się z receptorami P2X1 w mięśniach gładkich mięśnia detrusora i przewodu nasiennego. Jon Ca²⁺ wnika do mięśni gładkich, co prowadzi do powstania purynergicznych neuroefektorowych przejściowych zmian stężenia Ca²⁺ (NCTs). Ogniskowe zmiany stężenia Ca²⁺ umożliwiają optyczny monitoring uwalniania neuroprzekaźnika w sposób, który posiada wiele zalet w porównaniu z elektrofizjologią. Poza znacznie lepszą rozdzielczością przestrzenną, rejestracja optyczna daje dodatkową korzyść w postaci możliwości jednoczesnego rejestrowania uwalniania przekaźnika z wielu rozróżnialnych miejsc. Ponadto płaszczyznę ostrości optycznej łatwiej jest utrzymać lub skorygować podczas długich serii pomiarowych niż ponownie ustawić wewnątrzkomórkową ostrą mikroelektrodę.

Podsumowując, przedstawiono metodę obrazowania fluorescencji Ca²⁺, w której szczegółowo opisano przygotowanie tkanki oraz pozyskiwanie i analizę danych. Opisujemy wykorzystanie kilku skryptów do analizy takich stanów przejściowych Ca²⁺.

Protokół

Część 1: Przygotowanie wskaźnika Ca²⁺ (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM)

1. Oregon Green 488 BAPTA-1 AM dostarczany jest w fiolkach o objętości 500 μl w postaci niewielkiej ilości proszku (50 μg). Do proszku należy dodać 40 μl roztworu Pluronic F-127, delikatnie wstrząsając przez 30 s, a następnie dodać 460 μl PSS i ponownie delikatnie wstrząsać przez 30 s. Otrzymany roztwór końcowy o stężeniu 10 μM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM pozwala na przygotowanie 4 alikwotów po 125 μl. Należy unikać ekspozycji na światło i przechowywać w temperaturze -20 °C.

Część 2: Obciążanie Ca²⁺

1. Wyjmij wskaźnik Ca²⁺ (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) z zamrażarki (-20 C) i pozostaw do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.
2. Odmij 1 ml PSS do probówki i umieść ją w łaźni wodnej. Napowietrzaj mieszaninę gazem 95% O₂ / 5% CO₂ z prędkością około 1 pęcherzyka na sekundę. Napowietrzacz musi być zabezpieczony w probówce, np. za pomocą korka lub Parafilmu.
3. Wypreparuj tkankę z organizmu i w szalce Petri wyłożonej Sylgardem ostrożnie usuń tkankę łączną. Niezależnie od rodzaju narządu mięśnia gładkiego, PSS należy wymieniać co 10 min, a tkankę należy dokładnie wypłukać (np. trzykrotnie wymieniając PSS) po wypreparowaniu. W przypadku przewodów nasiennych: można rozciąć narząd wzdłuż, aby uzyskać płat tkanki. W przypadku pęcherza moczowego: otwórz go wzdłuż od szyjki pęcherza (tylna część) do szczytu kopuły (przednia część). Przygotuj cztery paski o długości 6 – 8 mm i szerokości 1 – 2 mm wzdłuż powierzchni grzbietowej mięśnia detrusora, tnąc w kierunku dominujących pęczków mięśniowych.
4. Umieść wypreparowaną tkankę w „podgrzanym i napowietrzonym” PSS.
5. Dodaj 125 μl 10 μM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM do probówki i lekko wstrząśnij ręcznie w celu wymieszania.
6. Wznów napowietrzanie i pozostaw próbkę przykrytą folią. Czas potrzebny do wystarczającego wchłonięcia wskaźnika Ca²⁺ przez tkankę różni się w zależności od jej wielkości i grubości warstwy mięśnia gładkiego. Na przykład: od 70 min (detrusor myszy, mięsień anococcygeus szczura) do 120 min (detrusor szczura, przewód nasienny myszy).

Część 3: Przygotowanie tkanki „obciążonej Ca²⁺” do mikroskopii

Dokładne przypięcie tkanki jest niezbędne, aby zminimalizować jej spontaniczne ruchy (cecha charakterystyczna dla obrazowania komórek mięśni gładkich z relatywnie nienaruszonej tkanki) oraz ułatwić zlokalizowanie odpowiedniego miejsca do obrazowania (ponieważ płaski fragment tkanki można badać w dwóch wymiarach, a nie w trzech).

1. Płucz tkankę w napowietrzonym PSS przez co najmniej 5 mins.
2. Zamocuj tkankę w naczyniu preparacyjnym wyłożonym Sylgardem, (lekko) rozciągając ją w celu utworzenia płaskiego płata. Unikaj stosowania długich „szpilek”, które mogłyby zarysować obiektyw; zamiast nich użyj krótkich odcinków srebrnego drutu o średnicy 25-50 μm jako „szpilek” i wbijaj je pod kątem.
3. Umieść naczynie preparacyjne na stoliku mikroskopu, dbając o to, aby PSS nie wypłynął poza obszar naczynia wyłożony Sylgardem (ponieważ mogłoby to doprowadzić do zalania dużej powierzchni PSS w momencie rozpoczęcia superfuzji).
4. Włącz pompę, aby rozpocząć superfuzję preparatu roztworem PSS. Często stosuje się przepływ rzędu 100 ml na godzinę.
5. Włącz jednostkę grzejną.
6. Umieść rurki dopływowe i odpływowe oraz sondę temperatury na naczyniu preparacyjnym (mocując każdą z nich do metalowej listwy za pomocą magnesu u podstawy). Wysokość końcówki rurki odpływowej będzie determinować poziom PSS. Upewnij się, że odpływ faktycznie usuwa PSS (ponieważ początkowo może tak nie być).
7. Ustaw temperaturę na jednostce grzejnej tak, aby osiągnąć pożądaną wartość, np. 33-35 °C.
8. Pozostaw tkankę do equilibracji przez co najmniej 10 mins.

Część 4: Wybór obszaru do obrazowania

Ekspozycja na oświetlenie wzbudzające spowoduje fotoblaknięcie wskaźnika, dlatego należy unikać jego stosowania przez więcej niż kilka sekund naraz.

1. Używając obiektywu o małym powiększeniu (10x lub 20x), zastosuj epifluorescencję z wzbudzeniem światłem niebieskim, aby zobrazować mięśnie gładkie i zidentyfikować odpowiedni obszar do monitorowania. Wybór miejsca powinien opierać się na: ruchu (który powinien być minimalny) oraz liczbie komórek mięśni gładkich w polu widzenia. Jasne „struktury” mogą powodować dużą liczbę „fałszywie dodatnich” wyników w algorytmie detekcji obrazu, dlatego należy unikać miejsc z dużą liczbą (np.) przemieszanych komórek nabłonkowych lub fibroblastów.
2. Przełącz na obiektyw o większym powiększeniu (40x).
3. Obróć stolik lub oś optyczną tak, aby komórka (lub komórki) mięśnia gładkiego znajdowały się w pozycji poziomej (tj. równolegle do osi szybkiego skanowania).

Część 5: Mikroskopia konfokalna

Szczegóły dotyczące „konfiguracji” mikroskopu konfokalnego są specyficzne dla każdego typu urządzenia, jednak kluczowymi kwestiami są: prędkość (do większości przejściowych zmian stężeń Ca²⁺ wymagane jest minimum 5 Hz), rozdzielczość oraz wielkość pola widzenia (oba te parametry są kompromisem w stosunku do prędkości). Część poniższego protokołu odnosi się konkretnie do pionowego mikroskopu konfokalnego Leica SP2. Typowy protokół obejmuje: serię 100 klatek, rejestrowanych z częstotliwością 5 Hz (256 x 256 pikseli; ok. 100 x 100 μm) lub 13,5 Hz (256 x 64 pikseli; ok. 100 x 25 μm). Głowica skanująca jest ustawiona na ruch dwukierunkowy (aby zmaksymalizować prędkość akwizycji) i rejestruje obraz z częstotliwością 1000 Hz na linię.

1. Zwęź otwór blendy (pinhole) do rozmiaru jednej „tarczy Airy’ego”.
2. Ustaw moc lasera (488 nm) w zakresie od 25 do 35% na AOTF; wartość ta stanowi kompromis między jasnością a fotobleachingiem. (Ten drugi jest szczególnie problematyczny podczas długich rejestracji).
3. Pozyskaj sześć serii na każdy obszar oraz od czterech do sześciu obszarów na jedną „serię badawczą”. Zwyczajowo dąży się do monitorowania tych samych sześciu obszarów przed podaniem leku (tj. „kontrola”) i po jego podaniu, choć znaczny fotobleaching może zmusić eksperymentatora do odejścia od tego schematu.
4. W obrazowaniu Ca²⁺ niezbędne jest przeprowadzenie „kontroli czasowej”.

Część 6: Przygotowanie do analizy

1. Pobierz i zainstaluj program Image J ze strony: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Pobierz wersję odpowiednią dla Twojej platformy, a następnie zaktualizuj program do najnowszej wersji, pobierając najnowszy plik imageJ.jar ze strony http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar i zastępując nim stary plik. Użytkownicy komputerów Apple Mac: jeśli program działa powoli, upewnij się, że korzystasz z najnowszej wersji maszyny wirtualnej Java (JVM) dostępnej w Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).
2. Pobierz plik Excel_writer.jar ze strony: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html i zainstaluj go w katalogu Plugins [directory] > jar.
3. Skopiuj następujące pliki do katalogu Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Zainstaluj każdy z tych skryptów za pomocą funkcji Plugins [Menu] > Macros > Install… w programie ImageJ.
4. Używamy konfokalnego mikroskopu Leica SP2, którego oprogramowanie (Leica LCS) generuje każdą serię jako pojedynczy, wyświetlany w programie „film”, ale zapisuje ją jako poszczególne klatki. Aby zrekonstruować klatki w serie: (i) Upewnij się, że wszystkie klatki do rekonstrukcji znajdują się w jednym folderze (np. „DataFolder > Tiffs”). (ii) Wybierz Plugins [Menu] > Macros > Leica_SP2_Stacker. Wybierz katalog główny (np. „DataFolder”). Wybierz odpowiedni folder z listy rozwijanej (np. „Tiffs/”). Wybierz katalog wyjściowy lub utwórz nowy (np. „DataFolder > Stacks”). Skrypt zrekonstruuje następnie serie z poszczególnych klatek.

Część 7: Korekcja ruchu

Choć ruch obrazowanego miejsca można zminimalizować poprzez dokładne przypięcie i równomierne rozciągnięcie tkanki, niektóre organy mięśni gładkich wykazują skurcze spontaniczne, których nie można wyeliminować samym precyzyjnym przypięciem. W niniejszym materiale opisujemy zastosowanie ogólnodostępnego algorytmu, który wyrównuje lub dopasowuje klatki w obrębie serii.

1. Pobierz programy „StackReg” (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) oraz „TurboReg” (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
2. Zainstaluj każdy z nich w katalogu wtyczek, korzystając z opcji Plugins > Macros > Install…
3. Wczytaj stos obrazów do przetworzenia (File > Open…), a następnie przejdź do klatki, która wyraźnie pokazuje obszar zainteresowania. Pozostałe klatki zostaną wyrównane do tej klatki referencyjnej.
4. Wybierz Plugins > Stacks > StackReg. Przetestuj poszczególne rodzaje transformacji („Transformations”, tj. Translation, Rigid Body, Scaled Rotation, Affine), aby określić, która z nich jest najskuteczniejsza. (Więcej szczegółów: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)

Część 8: Algorytm detekcji cząstek

Dla każdego obrazowanego „miejsca” będą występować zmienne czynniki wpływające na detekcję przejściowych zmian stężenia Ca²⁺. Pomiar określonych właściwości każdego miejsca („parametry cząsteczkowe” – szczegóły poniżej) ułatwia proces detekcji. W związku z tym dla każdego miejsca oblicza się „próg dla wartości odjętej”, „próg dla stosunku” oraz „próg krawędzi komórki”.

1. Wtyczki [Menu] > Makra > Zainstaluj… i wybierz „JNCT0.08Release.ijm”.
2. Wtyczki [Menu] > Makra > załaduj stos (skrót: l). Wybierz serię i oblicz parametry cząsteczek:
   1. a. Próg dla wartości odjętej (= tło)
3. Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w miejscu, które uznajesz za „tło”.
4. Pomiar (skrót: m). Zanotuj średnią (MEAN).
   1. b. Obliczanie progu dla stosunku
5. Wybierz prostokątny ROI wokół optycznie płaskiego obszaru komórki lub komórek.
6. Pomiar (skrót: m). Zanotuj średnią (MEAN) i odchylenie standardowe (STANDARD DEVIATION).
7. Powtórz tę czynność jeszcze dwa razy LUB narysuj trzy ramki jednocześnie, trzymając klawisz „shift”.
8. Oblicz i zanotuj próg dla stosunku = (1+SD/mean) x 32, uśredniając wartości z trzech powtórzeń / miejsc.
   1. c. Próg krawędzi komórki
9. Obraz > Stosy > Projekcja Z... Wybierz typ projekcji: „Average intensity” (Średnia intensywność).
10. Obraz > Dopasuj > Próg.
11. Wybierz tryb czarno-biały.
12. Zdefiniuj górny limit suwaka „under” i zanotuj odpowiadającą mu wartość (po prawej stronie suwaka). Liczone będą tylko zdarzenia występujące w obszarach czarnych.
13. Kliknij „reset”.
14. Analiza stosów (skrót: 2).
15. Na tym etapie wybierz tylko jedną serię, tzn. „pierwszy plik” i „ostatni plik” powinny być takie same.
16. Wprowadź wartości „progu dla wartości odjętej”, „progu dla stosunku” oraz „progu krawędzi komórki”. Pozostałe ustawienia pozostaw w wartościach domyślnych.
17. Algorytm wygeneruje okno z dwoma panelami, w którym po lewej stronie wyświetlana jest przetworzona seria, a po prawej oryginalna. Przejrzyj je uważnie, aby ocenić liczbę wyników fałszywie dodatnich oraz przypadki, w których zdarzenia widoczne gołym okiem nie zostały wykryte. Aby uzyskać dokładniejsze wykrywanie przejściowych stężeń Ca²⁺, może być konieczne niewielkie dostosowanie niektórych „parametrów cząsteczek”. Choć przy pierwszej próbie proces ten może wydawać się nieco przypadkowy, szybko nabiera się wyczucia, które parametry są kluczowe.
18. Dla każdej serii algorytm generuje plik Excel, w którym szczegółowo opisano charakterystykę wykrytego zdarzenia (taką jak amplituda, powierzchnia i pozycja). Wyniki „fałszywie dodatnie” – zidentyfikowane podczas przeglądania plików obrazów wygenerowanych przez algorytm (np. krok 8.17) – można ręcznie usunąć z tego pliku Excel.

Dyskusja

Wybór fluorescencyjnego wskaźnika Ca²⁺

Jako wskaźnik Ca²⁺ wybrano Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, ponieważ (i) wykazuje on wysoką jasność w porównaniu z innymi wskaźnikami (np. Fluo-4 i Calcium Green)¹; (ii) jest czuły na fizjologiczne zmiany stężenia Ca²⁺ z wartością K_d o zbliżonej wielkości¹ do wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺ [Ca²⁺]i (np. w przewodach nasiennych²); (iii) wnika do wielu komórek mięśni gładkich, co umożliwia monitorowanie sprzężenia między tymi komórkami. Jednakże Oregon Green 488 BAPTA-1 AM jest wskaźnikiem Ca²⁺ niewymagającym pomiaru stosunkowego (non-ratioable), przez co nie może być łatwo wykorzystany do określenia bezwzględnego [Ca²⁺]_i. Ponadto, w wysokich stężeniach może on pełnić rolę bufora Ca²⁺ oraz ulec nasyceniu przy zmianach [Ca²⁺]_i o wysokiej amplitudzie.

Hamowanie kurczliwości spontanicznej

Spontaniczną kurczliwość organów z mięśni gładkich można zredukować farmakologicznie, na przykład poprzez blokowanie przepływu Ca²⁺ przez kanały Ca²⁺ typu L (np. za pomocą: nifedipinu³; diltiazemu⁴). Należy pamiętać, że leki te znacznie zmniejszą amplitudę błysków / przejściowych wzrostów stężenia Ca²⁺ w całej komórce.

Skurcz przewodów nasiennych wynika z połączenia przede wszystkim purinergicznej i noradrenergicznej neurotransmisji. Jednakże ogniskowe przejściowe wzrosty stężenia Ca²⁺ w tej tkance są niewrażliwe na blokadę receptorów noradrenergicznych (np. α₁ adrenoreceptora za pomocą prazosyny⁵), zatem ruch może być ograniczony bez wpływu na ogniskowe przejściowe wzrosty stężenia Ca²⁺.

Alternatywnie skurcz można zapobiec „poniżej” (downstream) poprzez inhibicję kinazy lekkich łańcuchów miozyny, np. za pomocą wortmanniny⁶.

Wnioski

Monitorowanie fluorescencji Ca²⁺ w rozdzielczości submikronowej jest potężną techniką badania efektów pozasynaptycznych uwalniania neuroprzekaźników^5,7 oraz uwalniania Ca²⁺ z wewnątrzkomórkowych magazynów (np. tzw. „iskier” ⁸). Analiza przejściowych zmian stężenia Ca²⁺ z wykorzystaniem opisanej tutaj metodologii jest bardziej efektywna kosztowo w porównaniu do komercyjnie dostępnych pakietów do analizy obrazu i umożliwia spersonalizowaną analizę dzięki niestandardowym wtyczkom Java dla programu ImageJ.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM	Invitrogen	O6807	10 x 50 μg
Roztwór Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP	roztwór 20% w DMSO
Pionowy mikroskop konfokalny Leica SP2	Leica Microsystems
Stół pneumatyczny (‘stanowisko pracy z izolacją wibracyjną’)	Newport Corp.	M-VW-3046-OPT-012140
Elastomer Sylgard 184	Dow Corning