Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

Podsumowanie

Szczegółowe metody obrazowania Ca²⁺ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych narządów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazów oraz analizę danych.

Streszczenie

Obrazowanie Ca²⁺ w mięśniach gładkich pozwala na wgląd w mechanizmy komórkowe, które nie muszą prowadzić do zmian potencjału błonowego, takie jak uwalnianie Ca²⁺ z magazynów wewnątrzkomórkowych, oraz umożliwia jednoczesne monitorowanie wielu komórek w celu oceny, na przykład, sprzężenia w tkance syncytialnej. Podkomórkowe przejściowe stężenia Ca²⁺ są powszechne w mięśniach gładkich, jednak ich dokładny pomiar jest trudny ze względu na problemy wynikające z ich stochastycznego występowania, często w szerokim polu widzenia, w organie podatnym na skurcze. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy serię protokołów obrazowania i rutyn analitycznych, aby w sposób zautomatyzowany rejestrować i analizować częstotliwość, lokalizację oraz amplitudę takich zdarzeń. Choć podejście to można zastosować w innych kontekstach, nasze prace koncentrują się na detekcji lokalnych purinergicznych przejść Ca²⁺ w celu lokalizacji uwalniania przekaźników z rozdzielczością submikronową.

ATP jest uwalniany jako kotransmiter z nerwów autonomicznych, gdzie wiąże się z receptorami P2X1 w mięśniach gładkich detrusora i przewodów nasiennych. Ca²⁺ wnika do mięśni gładkich, prowadząc do purynergicznych neuroefektorowych przejściowych wzrostów stężenia Ca²⁺ (NCTs). Ogniskowe przejściowe wzrosty stężenia Ca²⁺ umożliwiają optyczny monitoring uwalniania neurotransmiterów w sposób, który wykazuje wiele zalet w porównaniu z elektrofizjologią. Poza znacznie lepszą rozdzielczością przestrzenną, rejestracja optyczna daje dodatkową korzyść w postaci możliwości jednoczesnego rejestrowania uwalniania transmiterów z wielu rozróżnialnych miejsc. Co więcej, płaszczyznę ostrości optycznej łatwiej jest utrzymać lub skorygować podczas długich serii pomiarowych niż ponownie ustawić wewnątrzkomórkową ostrą mikroelektrodę.

Podsumowując, przedstawiono metodę obrazowania fluorescencji Ca²⁺, która szczegółowo opisuje przygotowanie tkanki oraz pozyskiwanie i analizę danych. Opisujemy zastosowanie kilku skryptów do analizy takich przejściowych zmian stężenia Ca²⁺.

Protokół

Część 1: Przygotowanie wskaźnika Ca²⁺ (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM)

1. Oregon Green 488 BAPTA-1 AM jest dostarczany w fiolkach o pojemności 500 μl w postaci niewielkiej ilości (50 μg) proszku. Do proszku należy dodać 40 μl roztworu Pluronic F-127, delikatnie wstrząsając przez 30 s, a następnie dodać 460 μl PSS i ponownie delikatnie wstrząsać przez 30 s. Otrzymany roztwór końcowy o stężeniu 10 μM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM pozwala na przygotowanie 4 aliquotów po 125 μl. Należy unikać ekspozycji na światło i przechowywać w temperaturze -20 °C.

Część 2: Obciążanie Ca²⁺

1. Wyjmij wskaźnik Ca²⁺ (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) z zamrażarki (-20 C) i pozostaw do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.
2. Odmij 1 ml PSS do probówki i umieść ją w łaźni wodnej. Napowietrzaj mieszaninę gazem 95% O₂ / 5% CO₂ z prędkością około 1 pęcherzyka na sekundę. Napowietrzacz musi być stabilnie zamocowany w probówce, np. za pomocą korka lub Parafilmu.
3. Wypreparuj tkankę z organizmu i w szalce Petri wyłożonej Sylgardem ostrożnie usuń tkankę łączną. Niezależnie od rodzaju narządu z mięśni gładkich, PSS należy wymieniać co 10 min, a tkankę należy dokładnie wypłukać (np. trzykrotnie wymieniając PSS) po wypreparowaniu. W przypadku przewodów nasiennych: rozważ rozcięcie narządu wzdłuż, aby uzyskać arkusz tkanki. W przypadku pęcherza moczowego: rozetnij go podłużnie od szyjki pęcherza (tylna część) do szczytu kopuły (przednia część). Przygotuj cztery paski o długości 6 – 8 mm i szerokości 1 – 2 mm wzdłuż powierzchni grzbietowej mięśnia detrusora, tnąc w kierunku dominujących pęczków mięśniowych.
4. Umieść wypreparowaną tkankę w „podgrzanym i napowietrzonym” PSS.
5. Dodaj 125 μl 10 μM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM do probówki i lekko potrząśnij ręcznie, aby wymieszać.
6. Wznów napowietrzanie i pozostaw próbkę przykrytą folią. Czas potrzebny na wystarczające wchłonięcie wskaźnika Ca²⁺ przez tkankę zależy od jej wielkości i grubości warstwy mięśni gładkich. Na przykład: od 70 min (detrusor myszy, mięsień anokocygeus szczura) do 120 min (detrusor szczura, przewód nasienny myszy).

Część 3: Przygotowanie tkanki „obciążonej Ca²⁺” do mikroskopii

Staranne przypięcie tkanki jest niezbędne, aby zminimalizować jej spontaniczne ruchy (cecha charakterystyczna obrazowania komórek mięśni gładkich z relatywnie nienaruszonej tkanki) oraz ułatwić zlokalizowanie odpowiedniego miejsca do obrazowania (ponieważ płaski fragment tkanki można badać w dwóch wymiarach, a nie w trzech).

1. Płucz tkankę w napowietrzonym roztworze PSS przez co najmniej 5 min.
2. Zamocuj tkankę w naczyniu preparacyjnym wyłożonym Sylgardem, (lekko) rozciągając ją, aby utworzyła płaską warstwę. Unikaj używania długich „szpilek”, które mogłyby porysować obiektyw; zamiast nich stosuj krótkie odcinki drutu srebrnego o średnicy 25-50 μm jako „szpilki” i wkładaj je pod kątem.
3. Umieść naczynie preparacyjne na stole mikroskopu, dbając o to, aby roztwór PSS nie wypłynął poza obszar wyłożony Sylgardem (ponieważ w momencie rozpoczęcia superfuzji może to doprowadzić do zalania PSS dużego obszaru).
4. Włącz pompę, aby rozpocząć superfuzję preparatu roztworem PSS. Często stosuje się przepływ rzędu 100 ml na godzinę.
5. Włącz jednostkę grzewczą.
6. Umieść rurki doprowadzające i odprowadzające oraz sondę temperatury na naczyniu preparacyjnym (mocując każdą z nich do metalowej listwy za pomocą magnesu u podstawy). Wysokość końcówki rurki odprowadzającej będzie determinować głębokość warstwy PSS. Upewnij się, że odpływ faktycznie usuwa PSS (ponieważ początkowo może tak nie być).
7. Ustaw temperaturę na jednostce grzewczej tak, aby osiągnęła pożądaną wartość, np. 33-35 °C.
8. Pozostaw tkankę do równowagi na co najmniej 10 min.

Część 4: Wybór obszaru do obrazowania

Ekspozycja na światło wzbudzenia spowoduje fotoblaknięcie wskaźnika, dlatego należy unikać jego stosowania przez więcej niż kilka sekund jednorazowo.

1. Przy użyciu obiektywu o małym powiększeniu (10x lub 20x) wykorzystaj epifluorescencję z pobudzeniem światłem niebieskim, aby zobrazować mięsień gładki i zidentyfikować odpowiedni obszar do monitorowania. Wybór miejsca powinien opierać się na: ruchu (który powinien być minimalny) oraz liczbie komórek mięśni gładkich w polu widzenia. Jasne „struktury” mogą powodować dużą liczbę „fałszywych wyników dodatnich” w algorytmie detekcji obrazu, dlatego należy unikać miejsc z dużą liczbą (np.) przeplatających się komórek nabłonkowych lub fibroblastów.
2. Przełącz na obiektyw o większym powiększeniu (40x).
3. Obróć stolik lub oś optyczną tak, aby komórka(i) mięśnia gładkiego znajdowała się poziomo (tzn. równolegle do osi szybkiego skanowania).

Część 5: Mikroskopia konfokalna

Szczegóły dotyczące konfiguracji mikroskopu konfokalnego są specyficzne dla każdego typu urządzenia, jednak kluczowymi kwestiami są: prędkość (dla większości przejściowych zmian stężenia Ca²⁺ wymagana jest prędkość minimum 5 Hz), rozdzielczość oraz wielkość pola widzenia (oba parametry są kompromisem w stosunku do prędkości). Część poniższego protokołu jest specyficzna dla pionowego mikroskopu konfokalnego Leica SP2. Typowy protokół obejmuje: serię 100 klatek, rejestrowanych przy 5 Hz (256 x 256 pikseli; ok. 100 x 100 μm) lub 13,5 Hz (256 x 64 piksele; ok. 100 x 25 μm). Głowica skanująca jest ustawiona na ruch dwukierunkowy (w celu maksymalizacji prędkości akwizycji) i rejestruje obraz z częstotliwością 1000 Hz na linię.

1. Zwęż otwór pinhole do jednej „tarczy Airy’ego”.
2. Ustaw moc lasera (488 nm) w zakresie od 25 do 35% na AOTF; wartość ta stanowi kompromis między jasnością a fotobleachingiem (ten ostatni stanowi szczególny problem podczas długich rejestracji).
3. Pozyskaj sześć serii na obszar oraz od czterech do sześciu obszarów na jedną „metodę traktowania”. Powszechną praktyką jest monitorowanie tych samych sześciu obszarów przed podaniem leku (tj. „kontrola”) oraz po jego podaniu, choć znaczny fotobleaching może zmusić eksperymentatora do odstąpienia od tej procedury.
4. W przypadku obrazowania Ca²⁺ niezbędne jest przeprowadzenie „kontroli czasowej”.

Część 6: Przygotowanie do analizy

1. Pobierz i zainstaluj program ImageJ ze strony: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Pobierz wersję odpowiednią dla Twojego systemu operacyjnego, a następnie zaktualizuj program do najnowszej wersji, pobierając najnowszy plik imageJ.jar ze strony http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar i zastępując nim stary plik. Użytkownicy Apple Mac: jeśli program działa wolno, upewnij się, że korzystasz z najnowszej wersji maszyny wirtualnej Java (JVM) dostępnej od firmy Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).
2. Pobierz plik Excel_writer.jar ze strony: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html i zainstaluj go w katalogu Plugins [directory] > jar.
3. Skopiuj następujące pliki do katalogu Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Zainstaluj każdy z tych skryptów, korzystając z funkcji Plugins [Menu] > Macros > Install… w programie ImageJ.
4. Używamy konfokalnego mikroskopu Leica SP2, którego oprogramowanie (Leica LCS) generuje każdą serię jako pojedynczy, możliwy do wyświetlenia „film” wewnątrz aplikacji, ale zapisuje ją jako oddzielne klatki. Aby zrekonstruować klatki w serie: (i) Upewnij się, że wszystkie „klatki” przeznaczone do rekonstrukcji znajdują się w jednym folderze (np. „DataFolder > Tiffs”). (ii) Wybierz Plugins [Menu] > Macros > Leica_SP2_Stacker. Wybierz katalog główny (np. „DataFolder”). Wybierz odpowiedni folder z listy rozwijanej (np. „Tiffs/”). Wybierz katalog wyjściowy lub utwórz nowy (np. „DataFolder > Stacks”). Skrypt zrekonstruuje następnie serie z pojedynczych klatek.

Część 7: Korekcja ruchu

Choć ruch obrazowanego obszaru można zminimalizować poprzez odpowiednie przypięcie i równomierne rozciągnięcie tkanki, niektóre narządy z mięśni gładkich wykazują skurcze spontaniczne, których nie da się wyeliminować samym precyzyjnym przypięciem. W niniejszym opracowaniu opisujemy zastosowanie bezpłatnie dostępnego algorytmu, który wyrównuje lub dopasowuje klatki w obrębie serii.

1. Pobierz programy „StackReg” (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) oraz „TurboReg” (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
2. Zainstaluj każdy z nich w katalogu wtyczek, korzystając z opcji Plugins > Macros > Install…
3. Wczytaj stos obrazów do przetworzenia (File > Open…), a następnie przejdź do klatki, która wyraźnie pokazuje obszar zainteresowania. Pozostałe klatki zostaną wyrównane do tej klatki referencyjnej.
4. Wybierz Plugins > Stacks > StackReg. Przetestuj poszczególne rodzaje przekształceń („Transformations”, np. Translation, Rigid Body, Scaled Rotation, Affine), aby ustalić, która metoda jest najskuteczniejsza. (Więcej szczegółów: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)

Część 8: Algorytm detekcji cząstek

Dla każdego obrazowanego „miejsca” (site) wystąpią różne czynniki wpływające na detekcję przejściowych zmian stężenia Ca²⁺. Pomiar określonych właściwości każdego miejsca („parametrów cząsteczek” – opisanych szczegółowo poniżej) ułatwia proces detekcji. W związku z tym dla każdego miejsca oblicza się „próg dla odejmowania” (threshold for subtracted), „próg dla stosunku” (threshold for ratio) oraz „próg krawędzi komórki” (cell edge threshold).

1. Wtyczki [Menu] > Makra > Zainstaluj… i wybierz plik „JNCT0.08Release.ijm”.
2. Wtyczki [Menu] > Makra > załaduj stos (skrót: l). Wybierz serię i oblicz parametry cząsteczek:
   1. a. Próg dla wartości odjętej (= tło)
3. Zaznacz prostokątny obszar ROI w miejscu, które uznajesz za „tło”.
4. Pomiar (skrót: m). Zanotuj średnią (MEAN).
   1. b. Obliczanie progu dla stosunku
5. Zaznacz prostokątny obszar ROI wokół optycznie płaskiego obszaru komórki(ek).
6. Pomiar (skrót: m). Zanotuj średnią (MEAN) oraz odchylenie standardowe (STANDARD DEVIATION).
7. Powtórz tę czynność jeszcze dwa razy LUB narysuj trzy ramki jednocześnie, trzymając klawisz „shift”.
8. Oblicz i zanotuj próg dla stosunku = (1+SD/mean) x 32, wyciągając średnią z wartości z trzech powtórzeń / miejsc.
   1. c. Próg krawędzi komórki
9. Obraz > Stosy > Projekcja Z... Wybierz typ projekcji: „Average intensity”
10. Obraz > Dopasuj > Próg.
11. Wybierz czarno-biały.
12. Zdefiniuj granicę „poniżej” (górny suwak) i zanotuj odpowiadającą jej wartość (po prawej stronie suwaka). Liczone będą tylko zdarzenia występujące w obszarach czarnych.
13. Kliknij „reset”.
14. Analiza stosów (skrót: 2)
15. Na tym etapie wybierz tylko jedną serię, tzn. „pierwszy plik” i „ostatni plik” powinny być takie same.
16. Wprowadź wartości „progu dla wartości odjętej”, „progu dla stosunku” oraz „progu krawędzi komórki”. Pozostałe ustawienia pozostaw w wartościach domyślnych.
17. Algorytm wygeneruje dwudzielne okno, w którym po lewej stronie wyświetlona jest przetworzona seria, a po prawej oryginalna. Przeanalizuj je uważnie, aby ocenić liczbę wyników fałszywie dodatnich oraz przypadki, w których zdarzenia widoczne gołym okiem nie zostały wykryte. Aby uzyskać dokładniejsze wykrywanie przejściowych zmian stężenia Ca²⁺, może być konieczna niewielka korekta niektórych „parametrów cząsteczek”. Choć proces ten przy pierwszej próbie może wydawać się nieco intuicyjny, szybko można wyczuć, które parametry są kluczowe.
18. Dla każdej serii algorytm generuje plik Excel, który szczegółowo opisuje charakterystykę wykrytego zdarzenia (taką jak amplituda, pole i pozycja). „Wyniki fałszywie dodatnie” – zidentyfikowane poprzez przegląd plików obrazów wygenerowanych przez algorytm (np. krok 8.17) – można ręcznie usunąć z tego pliku Excel.

Dyskusja

Wybór fluorescencyjnego wskaźnika Ca²⁺

Jako wskaźnik Ca²⁺ wybrano Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, ponieważ (i) charakteryzuje się wysoką jasnością w porównaniu z innymi wskaźnikami (np. Fluo-4 i Calcium Green)¹; (ii) jest czuły na fizjologiczne zmiany stężenia Ca²⁺ z wartością K_d o zbliżonej wielkości¹ do wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺ [Ca²⁺]i (np. w przewodach nasiennych²); (iii) przenika do wielu komórek mięśni gładkich, co umożliwia monitorowanie sprzężenia między komórkami mięśni gładkich. Jednakże Oregon Green 488 BAPTA-1 AM jest wskaźnikiem Ca²⁺ niewymagającym pomiaru stosunku (non-ratioable), przez co nie może być łatwo wykorzystany do wyznaczenia bezwzględnego [Ca²⁺]_i. Ponadto, w wysokich stężeniach może on pełnić funkcję buforu dla Ca²⁺ i ulegać nasyceniu przy zmianach [Ca²⁺]_i o wysokiej amplitudzie.

Hamowanie kurczliwości spontanicznej

Spontaniczną kurczliwość narządów z mięśni gładkich można zredukować farmakologicznie, na przykład poprzez blokowanie przepływu Ca²⁺ przez kanały Ca²⁺ typu L (np. za pomocą: nifedypiny³; diltiazemu⁴). Należy pamiętać, że leki te znacznie zmniejszą amplitudę błysków / przejść Ca²⁺ w całej komórce.

Skurcz przewodów nasiennych wynika z połączenia neurotransmisji głównie purynergicznej i noradrenergicznej. Przejściowe wzrosty stężeń Ca²⁺ w tej tkance są jednak niewrażliwe na blokadę receptorów noradrenergicznych (np. adrenoreceptorów α₁ przez prazosynę⁵), zatem ruch może zostać ograniczony bez wpływu na ogniskowe przejścia Ca²⁺.

Alternatywnie skurcz można zapobiec „poniżej” poprzez hamowanie kinazy lekkich łańcuchów miozyny, np. za pomocą wortmanniny⁶.

Wnioski

Monitorowanie fluorescencji Ca²⁺ w rozdzielczości submikronowej jest potężną techniką badania efektów pozasynaptycznych uwalniania neurotransmiterów^5,7 oraz uwalniania Ca²⁺ z wewnątrzkomórkowych magazynów (np. tzw. „iskier” – „sparks”⁸). Analiza przejściowych zmian stężenia Ca²⁺ z wykorzystaniem opisanej tutaj metodologii jest bardziej efektywna kosztowo w porównaniu do dostępnych komercyjnie pakietów do analizy obrazu i umożliwia spersonalizowaną analizę dzięki dedykowanym wtyczkom Java napisanym dla programu ImageJ.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM	Invitrogen	O6807	10 x 50 μg
Roztwór Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP	roztwór 20% w DMSO
Pionowy mikroskop konfokalny Leica SP2	Leica Microsystems
Stół pneumatyczny (‘stanowisko pracy izolowane od wibracji’)	Newport Corp.	M-VW-3046-OPT-012140
Elastomer Sylgard 184	Dow Corning