Transplantacja soczewki u rybek zebrafish i jej zastosowanie w analizie mutantów oka

Podsumowanie

Rozwój soczewki wiąże się z interakcjami z innymi tkankami. Kilka mutantów oka u danio pręgowanego charakteryzuje się nienaturalnie małym rozmiarem soczewki. W niniejszym opracowaniu prezentujemy eksperyment z transplantacji soczewki, mający na celu ustalenie, czy fenotyp ten wynika z przyczyn wewnętrznych, czy z wadliwych interakcji z tkankami otaczającymi soczewkę.

Streszczenie

Soczewka odgrywa istotną rolę w rozwoju pucharu optycznego^[1,2]. Wykorzystując danio pręgowanego jako organizm modelowy, można analizować pytania dotyczące rozwoju soczewki. Danio pręgowany jest użyteczny w badaniach genetycznych dzięki kilku korzystnym cechom, takim jak niewielki rozmiar, wysoka płodność, krótki cykl życiowy i łatwość hodowli. Rozwój soczewki u danio pręgowanego przebiega szybko. Do 72 hpf soczewka danio pręgowanego jest funkcjonalnie dojrzała ^[3]. Dostępne są liczne zasoby genetyczne i molekularne wspierające badania na tym gatunku. Ponadto podobieństwo oka danio pręgowanego do oczu innych kręgowców stanowi podstawę do jego wykorzystania jako doskonałego modelu zwierzęcego dla ludzkich wad^[4-7]. Kilka mutantów danio pręgowanego wykazuje nieprawidłowości soczewki, w tym wysoki poziom śmierci komórkowej, co w niektórych przypadkach prowadzi do całkowitej degeneracji tkanek soczewki ^[8].

Aby ustalić, czy nieprawidłowości soczewki wynikają z przyczyn wewnętrznych czy z wadliwych interakcji z otaczającymi tkankami, przeprowadza się transplantację soczewki mutanty do oka typu dzikiego. Przy użyciu wypolerowanych ogniowo igieł metalowych soczewki mutanty lub typu dzikiego są ostrożnie wycinane z organizmu dawcy, a następnie przenoszone do biorcy. W celu rozróżnienia tkanek typu dzikiego i mutantów jako dawca wykorzystywany jest szczep transgeniczny. Linia ta wykazuje ekspresję GFP związanego z błoną w all tkankach, w tym w soczewce. Ta technika transplantacji jest niezbędnym narzędziem w badaniach mutantów soczewki u danio przebrondego.

Protokół

Część 1: Przygotowanie embrionów

W niniejszym protokole będziemy używać symbolu jj^xy do oznaczenia hipotetycznego mutanta soczewki danio pręgowanego.

1. Szczepy danio pręgowanego utrzymuje się w standardowych warunkach w pracowni ryb w temperaturze 28.5 °C w cyklu 14h światła / 10h ciemności.
2. Wieczorem umieszcza się samce i samice szczepu danio pręgowanego jj^xy:AB/TU; tg(mGFP) w zbiorniku z przegrodą oddzielającą obie płcie. Potomstwo z tego krzyżowania będzie wykazywać ekspresję transgenu GFP we wszystkich tkankach i zostanie wykorzystane jako dawcy. Równolegle stosuje się tę samą procedurę w celu przygotowania krzyżowań między nietransgenicznymi zwierzętami typu dzikiego. W zależności od celu eksperymentu, jako dawców lub biorców można wykorzystać zwierzęta typu dzikiego w locus jj^xy.
3. W ciągu godziny od zapalenia światła rano należy usunąć przegrody, aby umożliwić rybom rozród.
4. Po 15-30 minutach zbiera się zarodki do szalek Petriego o wymiarach 100 x 15 mm, oczyszcza je i wymienia medium (wodę do jaj).
5. Zarodki przechowuje się w inkubatorze w temperaturze 28.5 °C do wyznaczonego czasu.
6. Przed rozpoczęciem transplantacji należy ręcznie usunąć chorion za pomocą dwóch par ostrych pęset, a następnie inkubować zarodki w 0.2% EDTA w bezwapniowym medium ZFR przez 30 minut.

Część 2: Przygotowanie igieł do sekcji

1. Procedura transplantacji wymaga dwóch rodzajów igieł: ostrej, służącej do nacinania tkanek wokół soczewki, usuwania chorionu oraz uwalniania embrionów z agarozy, oraz tępej, służącej do przesuwania soczewki dawcy i wprowadzania jej do biorcy. W tej części pokażemy, jak wykonać te igły.
2. W pierwszej kolejności należy odciąć końcówkę pipety Pasteura za pomocą noża diamentowego. Następnie do końcówki pipety Pasteura należy wsunąć kapilarę szklaną w taki sposób, aby około połowa jej długości znajdowała się wewnątrz. Ułatwi to unieruchomienie drutu wolframowego poprzez jego stopienie ze szkłem w kolejnym kroku.
3. Następnie do otwartego końca kapilary należy wsunąć cienki drut wolframowy. Szkło nad drutem należy stopić przy użyciu palnika Bunsena. Przytrzymując pęsetą szklany koniec z metalowym drutem, należy dłonią skręcać drugi koniec igły. Zmiękczone szkło powinno owinąć się wokół metalu, mocując go w miejscu.
4. Jeśli wykonujemy igłę o tępym czubku, procedura dobiega końca. Aby stworzyć igłę ostrą, należy trzymać drut wolframowy nad palnikiem Bunsena przez 1-1,5 minuty, wypalając metal, aż powstanie bardzo cienka końcówka. Jakość czubka należy sprawdzić pod mikroskopem. Zaleca się sterylizację obu igieł w płomieniu przez kilka sekund bezpośrednio przed transplantacją.

Część 3: Przygotowanie odczynników

1. Roztwory Ringer’a dla danio pręgowanego (ZFR) bez zawartości wapnia (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 5 mM HEPES, pH 7.2)
2. 0.2% EDTA w roztworach Ringer’a dla danio pręgowanego bez zawartości wapnia (pH 7.2)
3. 1.2% agarozy (niskotopliwej) w bezwapniowym ZFR
4. 0.2% agarozy (niskotopliwej) w bezwapniowym ZFR
5. Pożywka dla embrionów (pH 7.0, na litr zawiera: 10 ml Hanks Solution #1, 1ml Hanks Solution #2, 10ml Hanks Solution #4, 10ml Hanks Solution #5, 0.35 g wodorowęglanu sodu, 300 uL 2M HCl, penicylina-streptomycyna 500,000U) Zgodnie z The Zebrafish Book (University of Oregon Press, 2000).
6. Drut wolframowy, pozłacany, średnica 0.1mm, Alfa Aesar
7. Kapilara, średnica 1.0mm, World Precision Instruments

Część 4: Procedura transplantacji

1. W plastikowej probówce wiriówkowej przygotuj 1,2% niskotopliwą agarozy w bezwapniowym ZFR, podgrzanym do 40 C w kąpieli wodnej.
2. W wybranym stadium (np. 30 hpf), pobierz embriony pipetą Pasteura, powoli przenieś je do probówki wiriówkowej i inkubuj przez około 5 sekund. Dawcy i biorcy powinni być inkubowani oddzielnie.
3. Za pomocą pipety pobierz embriony w 1,2% agarozy z probówki wiriówkowej i ułóż je w dwóch równoległych rzędach w 100mm polistyrenowej płytce Petriego, oddzielając biorców od dawców. Dzięki powolnemu i ostrożnemu wypuszczaniu, większość embrionów ułoży się na boku w agarozie. Te, które nie znajdą się w tej pozycji, należy zorientować za pomocą tępej igły tak, aby oko było skierowane do góry, zanim agarosa stężeje.
4. Odczekaj, aż 1,2% agarosa stężeje, a następnie przykryj ją 0,2% roztworem niskotopliwej agarozy.
5. Używając zaostrzonej igły, usuń agarozę wokół oczu i bardzo ostrożnie wycięcie soczewkę z embrionów biorcy i dawcy, wykonując krótkie ruchy. Upewnij się, że cięcie przebiega wystarczająco blisko soczewki, aby jej nie przerwać, ale jednocześnie nie usuwać zbyt wiele tkanki z reszty oka biorcy.
6. Po uwolnieniu soczewki będą unosić się w medium. Za pomocą tępej igły ostrożnie przesuń soczewkę dawcy dokładnie nad miejsce, w którym normalnie znajduje się soczewka biorcy, a następnie wciśnij ją do wnętrza oka. Soczewka biorcy może zostać usunięta.
7. Pozostaw embriony dawcy i biorcy w 1,2% agarozie przez 30-60 minut, następnie uwolnij je z agarozy za pomocą ostrej igły i przenieś do płytki 24-dołkowej z medium dla embrionów. Każdy embrion powinien znajdować się w osobnym dołku. Prawidłowo oznakuj dołki, aby było jasne, który biorca odpowiada któremu dawcy.
8. Inkubuj w temperaturze 28,5 C. Soczewkę pochodzącą od dawcy można odróżnić od soczewki biorcy po nieoperowanej stronie tego samego zwierzęcia na podstawie fluorescencji GFP. Można również wykonać przekroje w celu pomiaru wielkości soczewki i ustalenia, czy różnicuje się ona prawidłowo.

Ryc. 1 Obraz przy niskim powiększeniu zaostrzonej igły używanej do przeszczepiania soczewki. Szklana kapilara (B) jest wkładana do pipety Pasteura (A), a cienki drut wolframowy (C) jest wprowadzany do otwartego końca kapilary. Szkło nad drutem jest zmiękczane za pomocą palnika Bunsena. Używając pincety, należy stabilnie trzymać szklany koniec z metalowym drutem, jednocześnie skręcając ręką drugi koniec pipety Pasteura. Zmiękczone szkło powinno owinąć się spiralnie wokół metalu, mocno go chwytając.

Rys. 2 Końcówki dwóch rodzajów igieł stosowanych do transplantacji soczewki.

Rys. 3 Zarodki poddano transplantacji soczewki w 30hpf. Przedstawiono zarodek dawcy (A, B), oko biorcy z przeszczepioną soczewką (C, D) oraz stronę kontrolną zarodka biorcy (E, F). Każde oko pokazano w świetle przechodzącym oraz w oświetleniu UV, zgodnie z oznaczeniem. Zdjęcia wykonano w 48 hpf. W tym eksperymencie wykorzystano linię transgeniczną Q01^[9].

Dyskusja

Kilka etapów wymaga szczególnej uwagi podczas transplantacji soczewki.

1. Zaostrzone igły: Przed przeprowadzeniem transplantacji soczewki lepiej przygotować kilka igieł, a ich końcówki powinny być jak najcieńsze. Grubsza igła, ze względu na większą średnicę, przerwie więcej tkanek, co może uniemożliwić gojenie się oka.
2. Ułożenie embrionów: Bezpośrednio przed transplantacją należy ułożyć embriony na boku. Podczas pozycjonowania 1,2% agaroza może bardzo szybko stężeć. Aby spowolnić twardnienie agarozy, m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
drut wolframowy o średnicy 0,1mm	A Johnson Matthey	45086
Agaroza (niskotopna)	Sigma-Aldrich	39346
Kapilary z borokrzemianowego szkła	World Precision Instruments, Inc.	TW 100-4
Pęseta	Dumont	11252-30
Pipeta Pasteura	Fisher Scientific	13-678-20C
Pompa do pipety	Fisher Scientific	13-683C
Szalka Petriego	Cardinal Health	D1906
Penicylina-streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140-122