Nieludzkie naczelne są istotnym gatunkiem translacyjnym dla naszego zrozumienia prawidłowych procesów zachodzących w mózgu. Organizacja anatomiczna mózgu naczelnych może dostarczyć ważnych informacji na temat stanów prawidłowych i patologicznych u ludzi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Disekcja mózgu naczelnych zwierząt niebędących ludźmi w przestrzeni stereotaksycznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykorzystanie naczelnych innych niż człowiek zapewnia doskonały model translacyjny dla naszego zrozumienia procesów rozwojowych i starzenia się u ludzi1-6Ponadto zastosowanie naczelnych niebędących ludźmi umożliwiło ostatnio naturalne modelowanie złożonych zaburzeń psychiatrycznych, takich jak nadużywanie alkoholu7W niniejszym opracowaniu opisujemy technikę blokowania mózgu w płaszczyźnie wieńcowej u małpy werwetki (Chlorocebus aethiops sabeus) w nienaruszonej czaszce w przestrzeni stereotaksycznej. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu zapewnia standardową płaszczyznę cięcia pomiędzy blokami i osobnikami oraz minimalizuje liczbę przekrojów częściowych między blokami. Cięcie bloku tkanki w płaszczyźnie czołowej ułatwia również wyznaczenie obszaru zainteresowania. Metoda ta pozwala na uzyskanie bloków o rozmiarach umożliwiających pracę, ponieważ jedna półkula małpy z gatunku vervet daje ponad 1200 przekrojów przy cięciu o grubości 50μm. Ponadto podział mózgu na bloki o wielkości 1cm ułatwia penetrację sacharozy w celu krioprotekcji i pozwala na krojenie bloku na standardowym kriostacie.
Protokół
Część 1: Obróbka wstępna tkanki
- Tkanka powinna zostać dobrze przepłukana paraformaldehydem, glutaraldehydem lub formaliną. Można to osiągnąć poprzez standardową perfuzję transkardialną, zazwyczaj stosowaną podczas pobierania innych organów. W niniejszym badaniu obiekt został głęboko uśpiony za pomocą chlorowodorku ketaminy (10 mg/kg, i.m.), uśmiercony przedawkowaniem pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, i.v.) i poddany perfuzji transkardialnej 0.1 M PBS aż do całkowitego upuszczenia krwi. Następnie przez 5 min zastosowano 4% roztwór paraformaldehydu w PBS (~1 liter).
Część 2: Blokowanie stereotaktyczne
- Przed umieszczeniem głowy w ramie stereotaktycznej należy wyznaczyć współrzędne zera płaszczyzny Horsley-Clarke/międzyusznej. Jest to teoretyczny punkt środkowy między uszami. Aby zmierzyć tę płaszczyznę, należy równomiernie dopasować pręty uszne w aparaturze, następnie umieścić ostrze skalpela w ramieniu manipulatora stereotaktycznego i zmierzyć punkt środkowy między prętami usznymi. Jest to istotne dla określenia miejsca blokowania tkanki w zależności od potrzeb badawczych. Po zakończeniu tego etapu czaszkę należy przygotować do unieruchomienia w aparacie stereotaktycznym.
- Aby umieścić głowę w ramie stereotaktycznej, należy usunąć żuchwę za pomocą kleszczykostrugów do kości i skalpela. Dodatkowo należy usunąć skórę, mięśnie i tkankę łączną, aby odsłonić czaszkę. Po usunięciu tkanki łącznej z czaszki należy odsłonić mózg, usuwając fragmenty sklepienia czaszki (część blaszkowatą kości potylicznej, a także kości ciemieniowe i czołowe). W niniejszym eksperymencie część sklepienia czaszki została już usunięta. Należy uważać, aby nie usunąć całkowicie kości skroniowych, ponieważ kanały słuchowe muszą pozostać nienaruszone, aby można było umieścić głowę w ramie stereotaktycznej. Z odsłoniętego mózgu należy usunąć pozostałą oponę twardą. Czaszka jest teraz gotowa do umieszczenia w ramie stereotaktycznej.
- W taki sam sposób, w jaki wykonuje się zabieg stereotaktyczny, należy wyregulować pręty oczne, podniebienne i uszne tak, aby głowa była stabilnie unieruchomiona w aparacie stereotaktycznym. Umieścić manipulator stereotaktyczny w wcześniej określonych współrzędnych przednio-tylnych (A/P) i przesunąć manipulator do bocznej części mózgu. Powoli opuścić ostrze do mózgu, całkowicie je wycofać, a następnie przesunąć w stronę przyśrodkową i ponownie opuścić ostrze. Powtarzać te dwa kroki, aż ostrze dotrze do bocznej części przeciwległej półkuli. Tak kończy się wykonanie pierwszego bloku czołowego. W przypadku kolejnych bloków czołowych należy przesunąć manipulator o 1cm w osi A/P i powtarzać czynność, aż cały mózg zostanie podzielony na bloki.
Część 3: Usuwanie mózgu z czaszki
- Zdejmij głowę z zestawu stereotaktycznego i utrzymaj odsłonięty mózg w zagłębieniu dłoni. Aby unieruchomić mózg, delikatnie ułóż go w dłoni i oprzyj mały palec o płaty czołowe, co zminimalizuje przemieszczanie się mózgu wewnątrz czaszki. W celu zapobiegania wysychaniu powierzchni opon miękkich mózgu, przykryj go kawałkiem gazy nasączonej PBS. Mocno chwyć głowę za czaszkę i odłup pozostałe części kości potylicznej i skroniowej wraz z kręgosłupem. Odsłoni to podstawę oraz boczne powierzchnie mózgu. Na koniec usuń pozostałą część kości czołowej oraz kość nosową, co umożliwi dostęp do opuszek węchowych. Ważne jest, aby kość czołową usunąć na samym końcu, ponieważ podczas usuwania podstawy czaszki mózg lekko się przemieszcza, a płaty czołowe mogą zostać uszkodzone o poszarpane krawędzie kości czołowej. Wytnij i usuń pozostałą oponę twardą. Ostrożnie unieś przednią część mózgu, wsuń skalpel pod spód i oddziel mózg od czaszki.
Część 4: Pomiary
- Przed zamrażaniem można wykonać szereg przydatnych pomiarów. Na przykład, za pomocą suwmiarki można zmierzyć oś A/P mózgu. Ponadto gęstość właściwą można określić poprzez zważenie mózgu, pomiar objętości metodą wypierania wody w cylindrze mierniczym, a następnie podzielenie masy przez objętość wypartej cieczy (Tabela 1).
Część 5: Zakończenie blokowania mózgu.
- Zazwyczaj, gdy ostrze skalpela zostaje wprowadzone do mózgu, nie jest ono wystarczająco długie, aby całkowicie przeniknąć przez pełną rozciągłość grzbietowo-brzuszną organu. Po usunięciu mózgu i wykonaniu pomiarów makroskopowych, należy użyć ostrza do krojenia tkanek i dokończyć blokowanie mózgu aż do jego strony brzusznej (Rycina 2).
- Przed zamrożeniem bloków konieczne jest zastosowanie krioprotekcji tkanki w stopniowanych roztworach sacharozy w buforze PBS (10%, 20% i 30%) utrzymywanych w temperaturze 4˚C, aż do momentu opadnięcia mózgu na dno. Zazwyczaj inkubacja w roztworze 10% trwa przez noc, w 20% od 2 do 3 dni, a w 30% dodatkowe 3 do 5 dni, zanim bloki opadną na dno naczynia. Zaleca się codzienną wymianę 30% roztworu sacharozy.
Część 6: Reprezentatywne wyniki
Po usunięciu mózgu z czaszki można wykonać szereg pomiarów morfologicznych. Obejmują one długość A/P, masę oraz gęstość właściwą (Tabela 1). Zazwyczaj dzielimy mózg na 6-7 bloków o wielkości 1cm (Rysunek 1). Każdy fragment jest następnie fotografowany (Rysunek 2) i może zostać dalej poddany sekcji w zależności od potrzeb badawczych lub przygotowany do zamrożenia w roztworach sacharozy o rosnącym stężeniu.
Obiekt | Długość A/P (mm) | Masa (gramy) | Wyporność wody (ml) | Gęstość właściwa (g/ml) |
| O2303-2-1-1 | 64.3 | 28.1 | 24 | 1.171 |
| O5180-1 | 71.3 | 38.7 | 34 | 1.138 |
| O2708-3-1 | 62.8 | 28.7 | 26 | 1.104 |
| O9184-4-2 | 65.3 | 29.5 | 24 | 1.229 |
| N459-1-14-2 | 68.2 | 31.6 | 26 | 1.215 |
| ŚREDNIA | 66.38 | 31.32 | 26.8 | 1.171 |
| ODCHYLENIE STANDARDOWE | 3.38 | 4.33 | 4.17 | 0.052 |
Tabela 1. Pomiary morfologii makroskopowej prawej półkuli mózgu 5-miesięcznych małp z gatunku vervet
Rycina 1. Schematy płaszczyzn czołowych wykorzystywanych do blokowania mózgu. Przedstawiono przykład zewnętrznego mózgu dorosłego małpy zielonki. Przykład procedury blokowania. Linie pionowe są rozmieszczone co 1cm, co zazwyczaj pozwala na uzyskanie 7 bloków czołowych z każdej półkuli.
Rycina 2. Bloki tkanki mózgowej w przestrzeni stereotaktycznej.Z każdego bloku zostanie pobranych około 200 przekrojów o grubości 50µm. Przy takim schemacie próbkowania pobranych zostanie ponad 1200 przekrojów przez korę oraz dodatkowe 400-500 z móżdżku przy cięciu w płaszczyźnie czołowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Małpka z St. Kitts (Chlorocebus aethiops sabeus) jest naczelnym z Nowego Świata, u którego wzorce i tempo rozwoju kory oraz struktur podkorowych mózgu są podobne do ludzkich. Gatunek ten był wykorzystywany do modelowania złożonych zaburzeń behawioralnych występujących u ludzi, takich jak zachowania lękowe, nadciśnienie8, hemisferektomia9, choroba Parkinsona10, choroba Alzheimera11 oraz nadużywanie alkoholu12. W ostatnim czasie gatunek ten posłużył do badania...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Ikiel Ptito za stałe wsparcie techniczne. Grant NSERC dla MP.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Skalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Ostrza do skalpela | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Nożyczki | Fine Science Tools | 14090-11 | Wystarczą dowolne nożyczki chirurgiczne |
| Kleszczyki kostne | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Pinceta | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Papier filtrujący | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Aparat stereotaktyczny | Kopf Instruments | ||
| Ostrze do krojenia tkanek | Thomas Scientific |
Bibliografia
- Gallagher, M., Rapp, P. R. The use of animal models to study the effects of aging on cognition. Annu Rev Psychol 48. , 339-370 (1997).
- Clancy, B., Darlington, R., Finlay, B. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
- Nowakowski, R. S., Rakic, P. The site of origin and route and rate of migration of neurons to the hippocampal region of the rhesus monkey. J Comp Neurol. 196, 129-154 (1981).
- Rakic, P., Bourgeois, J. P., Eckenhoff, M. F., Zecevic, N., Goldman-Rakic, P. S. Concurrent overproduction of synapses in diverse regions of the primate cerebral cortex. Science. 232, 232-235 (1986).
- Granger, B., Tekaia, F., Le Sourd, A. M., Rakic, P., Bourgeois, J. P. Tempo of neurogenesis and synaptogenesis in the primate cingulate mesocortex: comparison with the neocortex. J Comp Neurol. 360, 363-376 (1995).
- Zecevic, N., Rakic, P. Development of layer I neurons in the primate cerebral cortex. J Neurosci. 21, 5607-5619 (2001).
- Ervin, F. R., Palmour, R. M., Young, S. N., Guzman-Flores, C., Juarez, J. Voluntary consumption of beverage alcohol by vervet monkeys: population screening, descriptive behavior and biochemical measures. Pharmacol Biochem Behav. 36, 367-373 (1990).
- Palmour, R. M., Mulligan, J., Howbert, J. J., Ervin, F. Of monkeys and men: vervets and the genetics of human-like behaviors. Am J Hum Genet. 61, 481-488 (1997).
- Boire, D., Théoret, H., Ptito, M. Stereological evaluation of neurons and glia in the monkey dorsal lateral geniculate nucleus following an early cerebral hemispherectomy. Exp Brain Res. 142, 208-220 (2002).
- Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Redmond, D. E. J. r, Elsworth, J. D., Roth, R. H., Cornelius, S. K., Snyder, E. Y., Sladek, J. R. Jr Human neural stem cells migrate along the nigrostriatal pathway in a primate model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 211, 362-369 (2008).
- Lemere, C. A., Beierschmitt, A., Iglesias, M., Spooner, E. T., Bloom, J. K., Leverone, J. F., Zheng, J. B., Seabrook, T. J., Louard, D., Li, D., Selkoe, D. J., Palmour, R. M., Ervin, F. R. Alzheimer's disease abeta vaccine reduces central nervous system abeta levels in a non-human primate, the Caribbean vervet. Am J Pathol. 165, 283-297 (2004).
- Mash, D. C., Staley, J. K., Doepel, F. M., Young, S. N., Ervin, F. R., Palmour, R. M. Altered dopamine transporter densities in alcohol-preferring vervet monkeys. Neuroreport. 7, 457-462 (1996).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
