Bankowanie mózgów: maksymalne wykorzystanie materiału badawczego

Podsumowanie

Bankowanie mózgu i systematyczne pobieranie próbek materiału biologicznego stanowią podstawę do bezstronnej stereologii i pozwalają na maksymalne wykorzystanie danych uzyskanych z każdego preparatu.

Streszczenie

Nieobciążona stereologia jest metodą pozwalającą na dokładne i efektywne szacowanie całkowitej liczby neuronów (lub innego typu komórek) w danym obszarze zainteresowania¹Aby osiągnąć ten cel, należy zbadać od 6 do 10 systematycznych przekrojów obejmujących całą strukturę. Zazwyczaj wiąże się to z opracowaniem 1/5 przekrojów, co pozostawia znaczną ilość nieprzetworzonego materiału. W celu maksymalnego wykorzystania materiału proponujemy niedrogi sposób konserwowania utrwalonej tkanki w ramach długoterminowego planu przechowywania do badań. W miarę krojenia i przetwarzania tkanki w celu zastosowania pożądanego barwienia lub przeciwciała, co drugi przekrój powinien być systematycznie umieszczany w preparacie do konserwacji antygenów w temperaturze -20°C w celu późniejszego przetworzenia. Wykorzystując płytki 24-dołkowe, można rozmieszczać przekroje kolejno, aby ułatwić ich późniejsze wyjęcie. Stosując tę metodę, tkankę można przechowywać i poddawać badaniom immunohistochemicznym przez wiele lat.

Protokół

Część 1: Obróbka wstępna tkanki

1. Tkanka powinna zostać dobrze utrwalona poprzez perfuzję paraformaldehydem, glutaraldehydem lub formaliną. Można to osiągnąć za pomocą standardowej perfuzji transkardialnej, typowo stosowanej podczas pobierania innych organów. W niniejszym badaniu obiekt został głęboko zsedowany chlorowodorkiem ketaminy (10 mg/kg, i.m.), uśmiercony przedawkowaniem pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, i.v.) i poddany perfuzji transkardialnej 0,1 M PBS aż do całkowitego upłynnięcia krwi. Następnie zastosowano 4% roztwór paraformaldehydu w PBS przez 5 min (~1 litr).
2. Mózg należy zablokować stereotaktycznie, wyjąć z czaszki, zważyć i określić jego objętość². Następnie tkankę należy poddać krioprotekcji w roztworach sacharozy o stopniowanym stężeniu, aż do końcowego stężenia 30% sacharozy w buforze fosforanowym. Bloki tkanki należy następnie zamrozić w izopentanie w temperaturze -65°C i przechowywać w -80°C do momentu przygotowania skrawków.

Część 2: Próbkowanie systematyczne

1. Próbkowanie systematyczne opiera się na odpowiednim planie przygotowanym przed wykonaniem sekcji. Cały obszar zainteresowania w wymiarach rostralno-kaudalnych oraz grzbietowo-brzusznych powinien być precyzyjnie zdefiniowany. Pomocny w określeniu obszaru zainteresowania oraz jego długości jest atlas stereotaktyczny dla badanego gatunku. Po ustaleniu długości obszaru zainteresowania konieczne jest określenie interwału próbkowania. Na przykład, na podstawie atlasu stereotaktycznego ustala się, że całkowity zasięg rostralno-kaudalny obszaru zainteresowania przy sekcjonowaniu w płaszczyźnie czołowej wynosi w przybliżeniu 3mm. Następnie ustawia się kriostat na grubość sekcji 50μm, co przy takim parametrze daje 60 sekcji obejmujących cały zasięg rostralno-kaudalny obszaru zainteresowania. W typowym, nieobciążonym badaniu stereologicznym do uzyskania wiarygodnych wyników wymaganych jest od 6 do 10 sekcji pobranych systematycznie. W tym przykładzie 10 sekcji rozmieszczonych w równych odstępach w całym zasięgu rostralno-kaudalnym daje interwał próbkowania wynoszący 1/6 sekcji.

Część 3: Tworzenie banku mózgów

1. Po ustaleniu częstotliwości pobierania przekrojów, kolejnym krokiem jest określenie, które barwienia zostaną wykonane niezwłocznie. Na przykład, jeśli barwienie odbywa się fioletem krezylowym, na szkiełku zostanie umieszczony 1 z każdych 6 przekrojów. Będzie to seria 1. Jeśli wiadomo, że może istnieć kilka potencjalnych przeciwciał, które należy przetestować, ale chce się najpierw przeanalizować dane z barwienia podstawowego lub po prostu brakuje czasu na wykonanie immunohistochemii, pozostałe 5 serii przekrojów należy umieścić w kolejności ich wycięcia w dołkach zawierających antigen preserve (1% poliwinylo-pirolidonu, 50% glikolu etylenowego w 0,1M PBS, pH 7,4). Poniższa tabela przedstawia schemat pobierania obejmujący 1 szkiełko i 1 płytkę (standardowa płytka 48-dołkowa) z przekrojami jako część banku mózgów (Tabela 1).
   
   Tabela 1. Częstotliwość pobierania przekrojów w tym przypadku wynosi 1/6. Pierwszy przekrój zostaje umieszczony na szkiełku do barwienia fioletem krezylowym, a kolejne 5 przekrojów trafia do roztworu antigen preserve. Następnie przekrój numer 7 jest umieszczany na szkiełku, a przekroje 9-12 trafiają do antigen preserve. Cykl ten jest powtarzany, aż obszar zainteresowania lub blok tkanki zostanie w całości pocięty na przekroje.
2. Kolejnym krokiem jest całkowite pocięcie bloku tkanki na przekroje. Na uchwycie (chuck) należy umieścić niewielką ilość medium do zatapiania i pozwolić mu zamarznąć. Uchwyt należy włożyć do głowicy mikrotomu i ściąć wystarczającą ilość zamrożonego medium, aby uzyskać płaską powierzchnię. Należy wyjąć uchwyt z głowicy mikrotomu i położyć go płasko w kriotomie. Na uchwyt należy nalać medium do zatapiania, a następnie stabilnie przyłożyć blok mózgu stroną przeciętą stereotaktycznie płasko do uchwytu. Należy powoli i całkowicie zatopić mózg w medium montującym. Uchwyt z mózgiem należy umieścić w głowicy mikrotomu i wykonać przekroje zgodnie z wcześniej ustalonymi parametrami częstotliwości pobierania.
3. Po całkowitym pocięciu bloku tkanki i umieszczeniu przekrojów w dołkach, płytkę należy przykryć pokrywką, zabezpieczyć ją parafilmem i umieścić w zamrażarce o temperaturze -20°C. Należy zarejestrować całkowitą liczbę pobranych przekrojów dla każdej serii, interwał pobierania przekrojów oraz liczbę serii dla każdego zwierzęcia. Rejestr ten będzie niezbędny do śledzenia późniejszego wyjmowania przekrojów z banku mózgów w celu przeprowadzenia przyszłych badań immunohistochemicznych.

Część 4: Reprezentatywne wyniki:

Systematyczne próbkowanie w ten sposób jest standardową praktyką w naszym laboratorium od 3 lat. Osiągnęliśmy duży sukces, przeprowadzając badania immunohistochemiczne na materiale przechowywanym w konserwatorze antygenów przez trzy lata od momentu pocięcia, bez pogorszenia jakości sygnału (Rycina 1). Ponadto, w ramach naszego banku mózgów, w ramach długoterminowych planów badawczych, zarchiwizowaliśmy blisko 20 000 systematycznych przekrojów mózgu naczelnych niebędących ludźmi (Rycina 2).

Rycina 1. Jest to przekrój z bieguna potylicznego mózgu naczelnego niebędącego człowiekiem, poddany immunostainingowi na NeuN, wykazujący neurony zarówno warstwy VI, jak i istoty białej śródmiąższowej. Ten konkretny przekrój był przechowywany w konserwatorze antygenów w temperaturze -20°C przez okres 2 lat. Pasek skali = 100µm.


Rycina 2. Nasz bank mózgów małp widliczek składa się obecnie z blisko 20 000 systematycznych przekrojów pochodzących od ponad 30 małp.

Dyskusja

Próbkowanie systematyczne to niedroga metoda mająca na celu maksymalne wykorzystanie materiału badawczego. Strategia ta została opracowana tak, aby spełniać zasady nieobciążonej stereologii, która wymaga systematycznego próbkowania w całym badanym obszarze. Kluczowe jest zachowanie kolejności przekrojów w każdej serii. W naszym laboratorium z sukcesem zastosowaliśmy tę metodę do tworzenia banków przekrojów mózgu chomika oraz naczelnych niebędących ludźmi. Do tej pory zebraliśmy prawie 20 000 przekrojów mózgu małpy werwet...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glikol etylenowy	Fisher Scientific	E178-4
Poliwinylo-pirrolidon	Fisher Scientific	BP431-500
Medium do zatapiania Thermal Scientific	Fisher Scientific