Nieludzkie naczelne są istotnym gatunkiem translacyjnym dla naszego zrozumienia rozwoju i starzenia się. Organizacja anatomiczna siatkówki naczelnych może dostarczyć ważnych informacji na temat stanów prawidłowych i patologicznych u ludzi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Brama do mózgu: sekcja oka naczelnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Układ wzrokowy u ludzi jest uważany za bramę do świata i odgrywa główną rolę w licznych procesach sensorycznych, percepcyjnych i poznawczych. Nie jest zatem zaskakujące, że jakość widzenia jest powiązana z jakością życia. Pomimo szeroko zakrojonych badań klinicznych i podstawowych nad przyczynami zaburzeń widzenia, wiele form upośledzenia wzroku, takich jak retinitis pigmentosa i zwyrodnienie plamki żółtej, nie posiada skutecznych metod leczenia. Naczelne niebędące ludźmi posiadają cechy rozwoju oka najbliższe tym u ludzi. Mają one nie tylko podobną anatomię naczyniową, ale spośród wszystkich ssaków naczelne charakteryzują się unikalną cechą w postaci obszaru w czasowej części siatkówki wyspecjalizowanego pod kątem wysokiej ostrości widzenia, czyli dołka środkowego.1W niniejszej pracy opisujemy ogólną technikę preparowania siatkówki naczelnych w celu pozyskania tkanki do badań histologicznych siatkówki, immunohistochemii, mikrodysekcji laserowej oraz mikroskopii świetlnej i elektronowej. Wraz z coraz szerszym wykorzystaniem naczelnych innych niż człowiek jako modelu translacyjnego, mamy nadzieję, że lepsze zrozumienie budowy i funkcji siatkówki pozwoli na opracowanie skutecznych metod łagodzenia lub odwracania negatywnego wpływu zaburzeń wzrokowych na jakość życia dotkniętych nimi osób.
Protokół
Część 1: Obróbka wstępna tkanki
- Tkanka powinna być dobrze przepłukana paraformaldehydem, glutaraldehydem lub formaliną. Można to osiągnąć poprzez standardową perfuzję transkardialną, zazwyczaj stosowaną podczas pobierania innych narządów. Zaleca się, aby krótko po uśmierceniu zwierzęcia wstrzyknąć utrwalacz do oczu tuż pod soczewkę, a następnie przechowywać je w utrwalaczu.
- W niniejszym badaniu obiekt głęboko uspokojono za pomocą chlorowodorku ketaminy (10 mg/kg, i.m.), uśmiercono przedawkowaniem pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, i.v.) i poddano perfuzji transkardialnej 0.1 M PBS aż do całkowitego upuszczenia krwi. Następnie zastosowano 4% roztwór paraformaldehydu w PBS przez 5 min (~1 liter).
Część 2: Usunięcie gałki ocznej z oczodołu
- Aby ułatwić dostęp do gałki ocznej, zaleca się najpierw usunąć mózg. Po usunięciu mózgu cienkościenna kość oczodołu staje się wyraźnie widoczna. Za pomocą kleszczyków do kości należy powoli odłupywać ścianę oczodołu. Odciąć mięśnie gałki ocznej skalpelem i usunąć tkankę łączną z gałki ocznej. Ostrożnie przeciąć nerw wzrokowy; może on zostać wykorzystany w badaniach z użyciem mikroskopii elektronowej. Gałka oczna powinna zostać teraz uwolniona z jamy oczodołu.
Część 3: Wypreparowanie siatkówki z gałki ocznej
- Umieść oko w szalce Petriego z PBS, aby zapobiec wysychaniu siatkówki. Podczas sekcji pomocny, choć nie niezbędny, jest mikroskop stereoskopowy lub zamontowany na stole statyw z lupą i oświetleniem. Usuń rogówkę, przecinając twardówkę blisko obwodu rogówki na poziomie ora serrata za pomocą nożyczek sprężynowych, a następnie usuń soczewkę pęsetą.
- Użyj pędzla, pęsety i nożyczek sprężynowych, aby oddzielić siatkówkę od twardówki. Wykonuje się to poprzez odseparowanie siatkówki od twardówki, a następnie odcięcie twardówki nożyczkami. Proces ten należy przeprowadzać małymi etapami, aby nie uszkodzić i nie przerwać tkanki siatkówki. Twardówka nie oddziela się łatwo od pozostałości nerwu wzrokowego, dlatego należy ostrożnie odciąć twardówkę wokół nerwu wzrokowego.
- Na tym etapie siatkówka zachowuje swój zakrzywiony kształt i musi zostać spłaszczona w celu pobrania próbek. Przed spłaszczeniem siatkówki można usunąć w jednej całości ciało szkliste, które ma konsystencję galaretki. Aby spłaszczyć siatkówkę na szkiełku, wykonaj kilka cięć promieniowych ostrzem skalpela. Pozostałości ciała szklistego można teraz usunąć za pomocą zwykłego papieru filtracyjnego i pędzla. Na tym etapie odsłonięta jest warstwa komórek zwojowych siatkówki, dlatego podczas usuwania ciała szklistego niezbędna jest szczególna ostrożność. Jeśli nerw wzrokowy jest nadal przytwierdzony do tarczy nerwu wzrokowego, usuń go za pomocą ostrza skalpela i nożyczek sprężynowych, uważając, aby nie rozerwać siatkówki. Otrzymano w ten sposób preparat siatkówki w montażu płaskim (Rycina 1), a dołek środkowy powinien być widoczny jako ciemna plama w kierunku skroniowym/brzusznym od tarczy nerwu wzrokowego.
Część 4: Pobieranie próbek
- Istnieje szereg opcji pobierania próbek z siatkówki. W tym miejscu opiszemy przygotowanie preparatu typu flatmount oraz pobieranie próbek izodentrycznych. W obu procedurach siatkówkę należy rozłożyć na szkiełku (flatmount) warstwą włókien nerwowych skierowaną od szkiełka. Jeśli celem jest badanie warstwy komórek zwojowych siatkówki w preparacie flatmount, konieczne jest usunięcie lub wybielenie nabłonka pigmentowego. Aby usunąć nabłonek pigmentowy, należy delikatnie użyć pędzla, co jednak ma tendencję do uszkadzania warstwy fotoreceptorów. Wybielanie polega na moczeniu siatkówki w roztworze nadmanganianu potasu (0,25%) przez 1 godzinę, płukaniu w wodzie destylowanej i klarowaniu w kwasie szczawiowym (5%) przez 5 minut.2
- Jeśli celem jest badanie rozkładu komórek i morfologii każdej warstwy w całej siatkówce, sugerujemy izometryczne pobieranie próbek z siatkówki. Siatkówkę należy rozłożyć na szkiełku (flatmount) i utrzymywać w wilgotności za pomocą PBS. Do pobierania izometrycznego należy wyciąć małe fragmenty tkanki w równych odległościach od tarczy nerwu wzrokowego w kierunkach: nosowym, skroniowym, górnym i dolnym (Rycina 1). W tym preparacie wybielanie nabłonka pigmentowego nie jest konieczne. Fragmenty te można teraz kroić w płaszczyźnie czołowej za pomocą kriotomu, wibratomu lub ultramikrotomu, w zależności od pytania badawczego. Do krojenia kriotomem fragmenty powinny być krio-chronione w 30% sacharozy przez noc i zamrożone w medium montującym na suchym lodzie. Alternatywnie próbki można zatopić w agarze i kroić na wibratomie. Preparaty z kriotomu i wibratomu pozwalają na uzyskanie przekrojów o grubości nawet 4 m. Jeśli wymagane są cieńsze przekroje (np. do preparacji do mikroskopu elektronowego), konieczne jest przygotowanie próbek do ultramikrotomu. W tym celu przekroje powinny zostać poddane post-fiksacji w tetroksydzie osmu przez 1 godzinę pod wyciągiem. Następnie przeprowadza się odwadnianie w szeregu stężeń etanolu (50, 70, 95, 95, 100, 100%) i 100% tlenku propylenu. Tkankę zatapia się następnie w Epon (zestaw do zatapiania EMBed-812).
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
W naszym laboratorium rutynowo wykonujemy immunohistochemię na krioprzestrojach siatkówki (Rysunek 2). W tym przypadku interesuje nas gęstość receptorów kannabinoidowych (CB1) w siatkówce naczelnych. Badamy również wpływ prenatalnej ekspozycji na etanol na układ wzrokowy naczelnych. W tym celu analizujemy gęstość komórek i grubość warstw w dołeczku środkowym oraz w obwodowej części siatkówki. Aby to osiągnąć, zatapiamy fragmenty siatkówki w Epon, wykonujemy skrawki o grubości 700nm przy użyciu ultramikrotomu i barwimy 1% błękitem toluidyny (Rysunek 3).
Rycina 1 Preparat płaski siatkówki. Do spłaszczenia siatkówki zastosowano cięcia radialne.
Rycina 2 Immunobarwienie. Krioprzekrój obwodowej części siatkówki poddany immunobarwieniu na CB1, w którym komórki zwojowe siatkówki wykazują silne znakowanie, z częściowym znakowaniem w wewnętrznej i zewnętrznej warstwie jądrowej. Grubość przekroju wynosi 14 m; barwienie wykonano bezpośrednio na szkiełku. RG – warstwa zwojowa siatkówki; IP – wewnętrzna warstwa splotowata; IN – wewnętrzna warstwa jądrowa; OP – zewnętrzna warstwa splotowata; ON – zewnętrzna warstwa jądrowa.
Rycina 3 Dołek środkowy. Przekrój przez dołek środkowy, który został zatopiony w Epon i pocięty na ultramikrotomie na grubość 700nm. Do wyrównania przekrojów wykorzystano warstwę fotoreceptorów (PR). Zauważalna jest pełna rozciągłość fotoreceptorów, co wskazuje na odpowiedni kąt w płaszczyźnie czołowej. Pomiary gęstości wykonano w odległości 300 m, 500 m i 800 m od centrum dołka środkowego przy użyciu systemu obrazowania Bioquant.
RG – warstwa zwojowa siatkówki; IP – wewnętrzna warstwa splotowa; IN – wewnętrzna warstwa jądrowa; OP – zewnętrzna warstwa splotowa; ON – zewnętrzna warstwa jądrowa; pasek skali = 50 m
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przygotowanie siatkówki w formie preparatu całego organu (wholemount) umożliwia analizę topografii i rozkładu przestrzennego warstwy komórek zwojowych lub komórek śródbłonka naczyń krwionośnych siatkówki3. Ilościowe określenie gęstości komórek w obwodowej części siatkówki naczelnych jest łatwe do przeprowadzenia. Jednak w obszarach okołopławkowych i w obrębie plamki żółtej nakładanie się wielu warstw w warstwie komórek zwojowych utrudnia kwantyfikację. Aby uniknąć tego potencjalnego błędu, plamkę żółtą oraz ob...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Ikielowi Ptito za wsparcie techniczne. Jesteśmy wdzięczni Frankowi Ervinowi, Robercie Palmour oraz personelowi Behavioural Sciences Foundation Laboratories znajdującym się w St Kitts, na Antylach Zachodnich, za nieustające wsparcie naszych prac nad naczelnymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Skalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Ostrza do skalpela | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Nożyczki | Fine Science Tools | 14090-11 | Wystarczy dowolny rodzaj nożyczek chirurgicznych |
| Kleszczyki kostne | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Pinceta | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Papier filtracyjny | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Pędzel z włosia wielbłąda lub sobola | Dowolny dostawca |
Bibliografia
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
