Anatomiczna organizacja mózgu naczelnych może dostarczyć istotnych informacji na temat stanów prawidłowych i patologicznych u ludzi. Obiektywna stereologia jest metodą dokładnego i wydajnego szacowania całkowitej liczby neuronów (lub innego typu komórek) w danym obszarze referencyjnym1.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wiedza o tym, co liczy się w analizie: nieobciążona stereologia w mózgu naczelnych zwierząt niebędących ludźmi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nieludzkie naczelne stanowią ważny gatunek translacyjny dla zrozumienia prawidłowego funkcjonowania i procesów chorobowych ludzkiego mózgu. Bezośrodkowa stereologia, metoda uznana za najnowocześniejszą w zakresie kwantyfikacji obiektów biologicznych w przekrojach tkanek2generuje wiarygodne dane strukturalne dotyczące cech biologicznych w mózgu ssaków3Kluczowymi elementami tego podejścia są nieobciążone (systematyczno-losowe) próbkowanie struktur zdefiniowanych anatomicznie (przestrzeni referencyjnych), połączone z kwantyfikacją liczby i wielkości komórek, długości włókien i kapilar, powierzchni, objętości regionalnych oraz rozmieszczenia przestrzennego obiektów biologicznych w obrębie przestrzeni referencyjnej4Jedną z zalet tych podejść stereologicznych w porównaniu z poprzednimi metodami jest uniknięcie wszystkich znanych źródeł błędów systematycznych (nielosowych), wynikających z błędnych założeń i nieweryfikowalnych modeli. Niniejsze badanie dokumentuje biologiczne zastosowanie stereologii komputerowej do oszacowania całkowitej populacji neuronów w korze przedczołowej mózgu małpy wierzchołkowej (Chlorocebus aethiops sabeus), przy wsparciu dwóch dostępnych komercyjnie programów stereologicznych: BioQuant Life Sciences oraz Stereologer (Rysunek 1). Oprócz kontrastu i porównania wyników z obu programów BioQuant iStereologersystemy, niniejsze badanie dostarcza szczegółowego protokołu dlaStereologer system
Protokół
Część 1: Wstępne przygotowanie tkanki należy przeprowadzić zgodnie z metodą opisaną przez Burke et al. (2009)5.
- W skrócie: tkankę należy dokładnie perfundować paraformaldehydem, glutaraldehydem lub formaliną. Można to osiągnąć poprzez standardową perfuzję transkardialną, zazwyczaj stosowaną do pobierania innych organów. W niniejszym badaniu obiekt głęboko zsedowano za pomocą chlorowodorku ketaminy (10 mg/kg, i.m.), poddano eutanazji poprzez przedawkowanie pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, i.v.) i perfundowano transkardialnie 0.1 M PBS do całkowitego upłynnienia krwi. Następnie przez 5 min podano 4% roztwór paraformaldehydu w PBS (~1 litr). Tkankę należy dokładnie perfundować paraformaldehydem, glutaraldehydem lub formaliną. Mózg należy zablokować stereotaktycznie, usunąć z czaszki, zważyć, określić jego objętość, poddać krioprotekcji i zamrozić5.
Część 2: Systematyczne pobieranie próbek tkanki zgodnie z metodą Burke i wsp. (2009)6.
- W tym przykładzie skupiliśmy się na płacie czołowym mózgu małpy zielonki. Przestrzeń referencyjną zdefiniowano tak, aby obejmowała tkankę korową od bruzdy środkowej do bieguna czołowego lewej półkuli. Na potrzeby naszych badań serie ustawiono w odstępach co 1/10 przekrojów w całej korze, przy grubości przekroju 50µm. Jedną pełną serię zabarwiono fioletem krezylowym (seria nr 1). Serię 2 podzielono tak, aby połowę przekrojów zabarwić chlorkiem złota w celu uwidocznienia mieliny, a drugą połowę zabarwić na acetylocholinoesterazę (w celu wyznaczenia określonych obszarów podkorowych). Wszystkie pozostałe serie zdeponowano w konserwatorze antygenów w ramach naszych długoterminowych planów badawczych.
Część 3: Stereologia (szczegóły w publikacji Mouton 2002)4
- Całkowita szacunkowa liczba komórek (N) jest obliczana na podstawie następującego równania:
N = ssf-1 x asf-1 x tsf-1 x ΣQ-
Gdzie ssf to ułamek próbkowania przekrojów, asf to ułamek próbkowania powierzchni, tsf to ułamek próbkowania grubości (gdzie zmierzoną grubość tkanki dzieli się przez wysokość dissektora), a ∑Q- to całkowita liczba obiektów zainteresowania policzonych wewnątrz dissektora. Kolejne sekcje niniejszego protokołu pokazują, jak wyznaczyć ssf, asf, tsf oraz ∑Q.
- Ułamek próbkowania przekrojów (metoda niekomputerowa)
- Cała przestrzeń referencyjna musi być dobrze zdefiniowana w osiach przednio-tylnej oraz grzbietowo-brzusznej. W tym przykładzie interesował nas płat czołowy, który zdefiniowano jako obszar od wierzchołka bieguna czołowego (przednio) do bruzdy środkowej (tylnie) oraz bruzdy bocznej (brzusznie), z wyłączeniem wyspy.
- Dla płata czołowego tego konkretnego osobnika systematycznie pobrano łącznie 760 przekrojów, z czego 76 barwiono fioletem krezylowym. Ponieważ celem było pobranie 10 przekrojów z całej przestrzeni referencyjnej, próbkowano 1/6 przekrojów barwionych fioletem krezylowym, co doprowadziło do uzyskania ułamka próbkowania przekrojów na poziomie około 1/60. Losowo rozpoczęto od jednego z pierwszych 6 przekrojów barwionych fioletem krezylowym, a następnie systematycznie pobierano co 6. przekrój. W przypadku wybranego osobnika pobrano łącznie 13 przekrojów (Rysunek 2).
-
Ułamek próbkowania powierzchni (metoda komputerowa)
- Badanie pilotażowe pozwoli wyznaczyć optymalny rozmiar siatki, czyli ułamek próbkowania powierzchni, aby próbkować przestrzeń referencyjną za pomocą około 100-300 dissektorów. W obrębie płata czołowego rozmiar siatki 2500 µm2 pozwolił uzyskać średnio 254 dissektory dla tego osobnika (Rysunek 2). Rozmiar dissektora powinien pozwalać na policzenie od 0 do 5 obiektów, w tym przypadku neuronów.
- Ułamek próbkowania grubości (metoda komputerowa)
- W każdym miejscu lokalizacji dissektora mierzy się wysokość tkanki i pobiera ułamek tej wysokości; jest to znane jako ułamek próbkowania grubości. Aby wyznaczyć zmierzoną grubość, należy przesuwać ostrość w płaszczyźnie z, aż pierwsza komórka stanie się ostra, a następnie cofnąć się nieco do góry przekroju, tj. dopóki ostatni obiekt nie znajdzie się tuż poza zakresem ostrości. Aby wyznaczyć dół tkanki, należy przesuwać ostrość w płaszczyźnie z, aż komórki znajdą się tuż poza zakresem ostrości.
- Podczas ustawiania ostrości w płaszczyźnie z komórki powinny być zabarwione na każdej głębokości; jeśli tak nie jest, może to wskazywać na niepełną penetrację barwnika lub nierównomierne odwodnienie tkanki, wórego przypadku przekroje powinny zostać ponownie zabarwione. Środek ostrożności ten jest szczególnie istotny dla tkanek barwionych immunohistochemicznie, które wymagają penetracji immunozond przez stosunkowo grube przekroje tkankowe. Z tego powodu tkankę barwioną immunochemicznie należy lekko zabarwić barwnikiem bazofilnym (np. fioletem krezylowym, hematoksyliną), aby dokładnie wyznaczyć górną i dolną granicę przekroju oraz potwierdzić penetrację przeciwciała. W tym badaniu przekroje były cięte przy ustawieniu mikrotomu na 50µm. Po zakończeniu wszystkich procesów obróbki tkanki zmierzona grubość tkanki wynosiła średnio 17,9µm (Rysunek 2), przy średnim skurczu wynoszącym około 65%. Należy zauważyć, że wyniki te reprezentują typowy skurcz dla tkanek poddanych rutynowej preparatyce histologicznej7.
- Domyślna wysokość dissektora dla typowego badania wynosi 10µm. Różnica między wysokością dissektora a zmierzoną grubością przekroju to tzw. wysokość ochronna (guard height), czyli objętość tkanki, w której nie liczy się cech biologicznych. Zastosowanie wysokości ochronnej pozwala uniknąć błędów wynikających z uszkodzeń tkanki na powierzchniach cięcia (np. utrata fragmentów krawędzi).
- Całkowita liczba policzonych obiektów, ΣQ-
- Aby uniknąć błędów poznawczych wynikających z pomyłek w rozpoznawaniu, konieczne jest przestrzeganie standardowej definicji dla konkretnej, interesującej nas cechy biologicznej. W tym przypadku interesowało nas liczenie neuronów. Dlatego neuron zdefiniowano jako komórkę posiadającą widoczne, centralnie położone jąderko i wyraźnie zdefiniowaną cytoplazmę, podczas gdy komórkom glejowym zazwyczaj brakowało widocznych jąderek i cytoplazmy. W przypadku tego osobnika policzono 457 neuronów.
Część 4: Stereologer -- komputerowy system stereologiczny (Stereology Resource Center, Chester, MD)
- System Stereologer prowadzi użytkownika przez proces uzupełniania niezbędnych informacji krok po kroku. W sekcji „Study Information” (Informacje o badaniu) ustala się parametry badania. Ponieważ dla badania musi zostać zdefiniowana przestrzeń odniesienia, należy wybrać parametr objętości (dla przestrzeni odniesienia należy wybrać estymator Cavalieriego). Można tutaj również wybrać objętość obiektów, aby oszacować objętość ważoną liczbą dla populacji interesujących obiektów. W naszym przykładzie wybrano jedynie objętość przestrzeni odniesienia. Dla każdego obiektu należy wybrać liczbę i zdefiniować interesującą cechę, w tym przypadku neurony.
- Inicjalizacja przypadku (Case Initialization): W tej sekcji ustala się informacje o próbkowaniu. Należy wprowadzić interwał próbkowania bloków (jeśli oddzielne bloki tkanki zostały pocięte wyczerpująco i każdy przekrój jest ułożony w kolejności sekwencyjnej, należy wpisać tutaj 1). Należy wprowadzić całkowitą liczbę przekrojów wykonanych w przestrzeni odniesienia (w tym przypadku 760). Następnie wprowadza się interwał próbkowania przekrojów (w tym przypadku 59). System oblicza wtedy liczbę przekrojów do pobrania próbek (w tym przypadku 13).
- Parametry sondy (Probe Parameters): Ta sekcja definiuje rozmiar siatki i disektora. Dla objętości, w menu edycji, należy użyć małego powiększenia 2,5x-10x, aby zdefiniować odstępy siatki. Powiększenie obiektu powinno być ustawione na 100x (N.A. 1,3 lub 1,4). Pole ramki (Frame area) to rozmiar disektora; w tym przypadku użyliśmy 50% ekranu. Wysokość ramki (Frame height) to grubość disektora; tutaj ustawiono ją na 10µm. Odstęp ramki (Frame spacing) to rozmiar siatki. W naszym badaniu pilotażowym stwierdziliśmy, że 2500µm daje od 150 do 200 ramek rozmieszczonych w sposób systematyczno-jednorodny w stosunkowo dużej przestrzeni odniesienia. Dla mniejszych obszarów należy zastosować mniejszy rozmiar siatki. Badanie pilotażowe pozwoli określić parametry sondy optycznej dla każdego konkretnego badania.
- Po ustaleniu parametrów badania można przystąpić do próbkowania tkanki. Program poprosi o pobranie próbki z pierwszego przekroju. Krok 1: Program poprosi użytkownika, przy małym powiększeniu, o obrysowanie przestrzeni odniesienia na przekroju. System nałoży następnie siatkę na przekrój w oparciu o parametry sondy, a użytkownik zweryfikuje, czy punkty znajdują się w obrębie przestrzeni odniesienia. Jeśli punkt nie znajduje się w przestrzeni odniesienia, wystarczy w niego kliknąć, a nie zostanie on wliczony do objętości. Krok 2: System nałoży nową siatkę na przestrzeń odniesienia, w oparciu o parametry odstępów ramek. Należy zweryfikować, czy punkty przecięcia znajdują się w przestrzeni odniesienia. Krok 3: System poprosi następnie użytkownika o przełączenie na obiektyw o większym powiększeniu i przesunięcie stolika do pierwszego disektora. Krok 4: W tym momencie system prosi użytkownika o zdefiniowanie górnej i dolnej granicy przekroju, a następnie ustawia przestrzeń próbkowania w osi z. Krok 5: Użytkownik klika następnie w każdy obiekt, który znajduje się w disektorze w płaszczyźnie z. Obiekty dotykające czerwonych linii lub dna disektora nie mogą być liczone. Po policzeniu każdego obiektu należy kliknąć „dalej”. Stolik przesunie się do następnego disektora, a kroki 4 i 5 zostaną powtórzone. Po policzeniu wszystkich disektorów dla danego przekroju, system poprosi użytkownika o włożenie kolejnego sekwencyjnego przekroju do zbadania. Kroki 1-5 będą powtarzane, dopóki nie zostaną pobrane próbki ze wszystkich sekwencyjnych przekrojów. System przedstawi następnie obliczenia dla asf, ssf, tsf oraz ∑Q. Na podstawie tych parametrów system wygeneruje szacowane N, objętość odniesienia oraz błędy standardowe (CE) zarówno dla szacowanej liczby, jak i objętości. Przedstawi również zalecenia dotyczące zwiększenia wydajności lub zmniejszenia CE (Ryc. 2).
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
Obiektywna stereologia zapewnia wydajne i wiarygodne szacunki populacji komórek w obrębie przestrzeni referencyjnej. Dostępnych jest szereg komputerowych systemów stereologicznych, z których wszystkie opierają się na systematycznym próbkowaniu i zdefiniowanej przestrzeni referencyjnej. Wykorzystaliśmy system BioQuant Life Sciences, aby oszacować całkowitą populację neuronów w korze mózgowej 2-letnich zielaków, która wyniosła ponad 828 milionów (Rysunek 3), przy średnim błędzie szacunkowym (CE) wynoszącym 0,042. Następnie użyliśmy systemu Stereologer, aby oszacować, że płat czołowy odpowiada za około połowę liczby neuronów korowych8.
Rycina 1 Komputerowe systemy stereologiczne. Podstawowa konfiguracja systemów stereologicznych jest taka sama: mikroskop z zmotoryzowanym stolikiem (x-y-z), kontroler stolika, kamera wideo, komputer oraz oprogramowanie. Wybór konkretnego systemu powinien opierać się na analizie wydajności, potrzeb i kosztów.
| INFORMACJE O BADANIU | |
| Nazwa badania | Kora przedczołowa |
| Główny badacz | MB |
| Gatunek | AG |
| Przestrzeń odniesienia Kora przedczołowa | Kora |
| Uwagi | |
| INFORMACJE O PRÓBIE | |
| Osoba zbierająca dane | MB |
| Data | środa, 30 kwietnia 2008 |
| Grupa | Kontrolna |
| Obiekt | O26 |
| Uwagi | |
| CHARAKTERYSTYKA PRÓBKOWANIA | |
| Interwał próbkowania bloków | 1 |
| Całkowita liczba przekrojów | 760 |
| Interwał próbkowania przekrojów | 59 |
| Przekrój początkowy | 2 |
| FRAKCJE | |
| ASF | 0,0002 |
| SlabSF | 1,0000 |
| SSF | 0,0169 |
| TSF | 0,5587 |
| PODSUMOWANIE WYNIKÓW | |||||
| Parametr | Sonda | Nazwa | Wynik | CE | SD |
| Grubość | --- | --- | 17,8996 µ | --- | --- |
| Liczba | Disektor | neuron | 243833769,1473 | 0,0474 | N/D |
| Objętość | Siatka punktowa Cavaliera | objętość | 1719769397954,1284 µ^3 | 0,0078 | N/D |
| ZALECENIA | |
| Sonda | Liczba obiektów (neuron) |
| CE | 0,0474 |
| Zalecenia | Wartość CE jest akceptowalna. |
| Liczba obejrzanych disektorów jest zbyt wysoka, należy zwiększyć odstępy między disektorami. | |
| Sonda | Objętość regionu (objętość) |
| CE | 0,0078 |
| Zalecenia | Wartość CE jest akceptowalna. |
| WYNIKI DLA PRZEKROJÓW | ||
| Przekrój | neuron LiczbaObiektów neuron LiczbaNaroży | objętość PunktyReg |
| 1. 40 | 48 | 34 |
| 2. 26 | 52 | 44 |
| 3. 29 | 56 | 48 |
| 4. 39 | 100 | 83 |
| 5. 49 | 112 | 83 |
| 6. 53 | 156 | 120 |
| 7. 65 | 128 | 106 |
| 8. 45 | 108 | 100 |
| 9. 52 | 100 | 77 |
| 10. 26 | 64 | 60 |
| 11. 21 | 44 | 44 |
| 12. 11 | 36 | 32 |
| 13. 1 | 12 | 6 |
Rycina 2 Wyniki z płata czołowego uzyskane za pomocą systemu Stereologer. W przypadku płata czołowego najdłuższym etapem procesu stereologicznego było systematyczne próbkowanie i sekcjonowanie. Topografia, objętość i szacowanie liczby neuronów zostały ukończone w ciągu około jednego dnia dla każdego obiektu. Próbki pobrano z lewej półkuli, a wartość tę podwojono w tekście, aby uzyskać przybliżoną szacunkową liczbę dla obu półkul.
Rycina 3 Szacunkowa liczba populacji neuronów kory uzyskana za pomocą BioQuant. System BioQuant wymaga dokładnego określenia topografii przed przystąpieniem do zliczania komórek. W tym przypadku pobrano próbki ze średnio 13 przekrojów. Topografia kory i późniejsza estymacja objętości zajęły od 15 do 20 godzin dla każdego obiektu. Topografię wykonano przy użyciu obiektywu 2,5x, a zliczanie przeprowadzono za pomocą obiektywu imersyjnego olejowego 100x (N.A. 1,3). W całej lewej półkuli wybierano co setny przekrój, pobierając średnio 180 disektorów. Po zakończeniu topografii zliczanie neuronów trwało około jednego dnia. Próbki pobrano z lewej półkuli, a w tekście wartość tę podwojono, aby uzyskać przybliżoną estymację dla obu półkul.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obiektywna stereologia w mózgu naczelnych jest podobna do tej stosowanej w innych próbkach biologicznych. Jednakże, biorąc pod uwagę rozmiar mózgu naczelnych, zaleca się staranne zaplanowanie procesu, ponieważ pojedyncza półkula małpy werwetkowej daje ponad 1200 sekcji przy cięciu o grubości 50µm. W pierwszej kolejności zalecamy stereotaksyczne dzielenie mózgu na bloki o wymiarach 1cm, co zapewnia standardową płaszczyznę cięcia pomiędzy blokami i osobnikami, minimalizuje liczbę sekcji częściowych pomiędzy blokami oraz za...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Ikielowi Ptito za nieustające wsparcie techniczne. Grant NSERC dla MP.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stereologer | Stereology Resource Center (Chester, MD) | www.disector.com | |
| System Stereology Tool-Kit Stereologer | BioQuant Life Sciences (Nashville, TN) | ||
| StereoInvestigator | MBF Bioscience |
Bibliografia
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Saper, C. B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
- Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
- Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
- Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
