Różnicowanie laktogenne komórek HC11 można scharakteryzować poprzez tworzenie się struktur kopułkowatych, określanych jako mammosfery. Struktury te można zliczyć za pomocą mikroskopii fazowej, co ułatwia ilościowe określenie stopnia różnicowania laktogennego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysie komórki nabłonka gruczołu mlekowego tworzą mammosfery podczas różnicowania laktogennego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Miara fenotypowa powszechnie stosowana do określenia stopnia różnicowania laktogennego w kulturach komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego myszy to tworzenie struktur komórkowych w kształcie kopuły, nazywanych mammosferami1Linia komórkowa HC11 była wykorzystywana jako modelowy system do badania regulacji różnicowania laktogennego gruczołu piersiowego zarównoin vitroiin vivo 2Komórki HC11 różnicują się i syntetyzują białka mleka w odpowiedzi na działanie hormonów laktogennych. Po osiągnięciu przez mysie komórki nabłonka gruczołu mlekowego HC11 stanu konfluencji, różnicowanie laktogenne indukowano poprzez dodanie kombinacji hormonów laktogennych, w tym deksametazonu, insuliny i prolaktyny, określanej jako DIP. Komórki HC11 poddane indukcji różnicowania były fotografowane w odstępach czasu do 120 godzin po indukcji różnicowania, a następnie policzono liczbę mammosfer, które pojawiły się w każdej hodowli. Wielkość poszczególnych mammosfer koreluje ze stopniem różnicowania, co zostało przedstawione na zdjęciach różnicujących się komórek.
Protokół
- Komórki HC11 hodowano do uzyskania konfluencji przez 6 dni w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej, 5 μg/ml insuliny, 10 mM HEPES oraz 10 ng/ml czynnika wzrostu naskórka (EGF), aby uzyskać odpowiednią kompetencję.
- Komórki przemyto buforem PBS i utrzymywano w pożywce wzrostowej bez dodatku EGF przez 24 godziny.
- Aby indukować różnicowanie laktogenne, komórki inkubowano w pożywce różnicującej, tj. RPMI z deksametazonem (10-6 M), insuliną (5 μg /ml) i prolaktyną (5 μg /ml), określanej jako DIP.
- W wyznaczonych odstępach czasu po dodaniu DIP, mammosfery fotografowano i przeliczano za pomocą mikroskopii kontrastowej przy użyciu mikroskopu Olympus IX71 z kamerą cyfrową.
Reprezentatywne wyniki:
Na Rysunku 1 przedstawiono odpowiednio: małe powiększenie monowarstw normalnych komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego i licznych mammosfer, a także duże powiększenie pojedynczej mammosfery.
Rysunek 1. Mammosfery. (a) Normalne monowarstwy komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego powinny być widoczne jako płaska warstwa konfluencyjnych komórek. (b) Po 3-5 dniach stymulacji DIP pojawiają się liczne mammosfery. Fotografia wykonana 5 dni po dodaniu DIP. (c) Większe powiększenie pojedynczego pola zawierającego mammosfery w 5. dniu po dodaniu DIP.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby technika ta była skuteczna i zapewniła najwyższą jakość, komórki nabłonkowe muszą osiągnąć pełną konfluencję przed indukcją hormonami laktogennymi. Mogą wystąpić sytuacje, w których powstaje bardzo wiele mammosfer, co utrudnia ich kwantyfikację. Dlatego w celach ilościowych najlepiej fotografować mammosfery w punkcie czasowym, w którym ich liczba umożliwia dokładne przeliczenie.
Choć do określania stopnia różnicowania laktogennego komórek nabłonka gruczołu mlekowego stosuje się różne mark...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Pracę wsparto środkami z grantu Congressionally Directed Medical Research Fund (DAMD17-01-0264) dla M.L. Cutler oraz United States Military Cancer Institute dla M.L. Cutler.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Pł Tk. Bydło (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamina | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulina | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dekzametazon | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Mikroskop | Olympus Corporation | IX71 | |
| Kamera cyfrowa | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
Bibliografia
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
