$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Aby pracować w sterylnych warunkach, zaleca się wykonywanie wszystkich kroków w okapie z przepływem laminarnym.
1. Materiały
- Bufor HEPES: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2)
- Roztwór kolagenazy D: Kolagenaza D: 100 mg/ml (kolagenaza D > 0,15 j./mg), w buforze HEPES
- Roztwór DNazy I: 20 000 U/ml DNazy I
- Bufor PBS o pH 7,2
- Bufor PEB: 1 część roztworu podstawowego BSA w 20 częściach roztworu płuczącego autoMACS
- Tkanka: płuco pochodzące od 6/7 tygodniowej dorosłej samicy myszy BALB/C, wolne od sąsiednich narządów.
- Opcjonalnie: Mikrokulki CD11c, kolumny MACS MS, separator MACS do izolacji komórek dendrytycznych z zawiesiny jednokomórkowej płuc myszy
2. Dysocjacja tkanki płucnej
- Wypłucz tkankę na szalce Petriego zawierającą PBS w celu usunięcia erytrocytów.
- Przenieść maksymalnie 450 mg tkanki płucnej do probówki gentleMACS C zawierającej 4,9 ml buforu HEPES.
- Dodać 100 μl roztworu kolagenazy D do końcowego stężenia 2 mg/ml kolagenazy D.
- Dodać 10 μl roztworu DNazy I dla objętości tkanki 150 mg (końcowe stężenie 40 U/ml DNazy I) lub 20 μl roztworu DNazy I dla tkanki płucnej 150-450 mg (końcowe stężenie 80 U/ml DNazy I).
- Szczelnie zamknij rurkę C i przymocuj ją do dysocjatora gentleMACS. Następnie uruchom program "m_lung_01".
- Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C z automatycznym obracaniem lub ręcznym obracaniem co 5 minut.
- Zwróć próbkę do dysocjatora gentleMACS i uruchom program "m_lung_02".
3. Filtracja
- Przygotuj probówkę o pojemności 50 ml do zbierania przefiltrowanych komórek, zastępując nasadkę sitkiem siatkowym o wielkości 70 μm.
- Po zakończeniu drugiego programu gentleMACS, w zależności od rozkładu materiału próbki w probówce, można krótko odwirować probówkę, aby zebrać materiał próbki na dnie probówki.
- Usuń komórki przez uszczelnioną przegrodę nasadkę rurki C za pomocą odpowiedniej końcówki pipety 1000 μl i nałóż je na sitko do komórek.
- Przemyć sitko do komórek 5 ml buforu HEPES w temperaturze pokojowej.
- Odwiruj komórki do postaci osadu w probówce o pojemności 50 ml i natężeniu 300 x g przez 10 minut.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w żądanej objętości buforu PEB.
Część 4: Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 1. Dysocjacja płuc za pomocą dysocjatora gentleMACS™ spowodowała powstanie 92% żywotnych komórek. Martwe komórki barwiono fluorescencyjnie jodkiem propidyny (PI) (prawy wykres kropkowy; lewy wykres kropkowy: brak barwienia PI).
Rysunek 2. Dysocjacja tkanki płucnej myszy za pomocą dysocjatora gentleMACS skutkuje wysokim odsetkiem żywotnych leukocytów i komórek śródbłonka. Otrzymane zawiesiny jednokomórkowe wybarwiono CD45-PE i CD146-FITC lub CD31-FITC i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej.
Rysunek 3. Zawiesinę jednokomórkową pochodzącą z tkanki płucnej myszy wybarwiono CD11c-FITC i anty-mPDCA-1-APC w celu wykrycia mysich plazmocytoidów DC CD11co niskiej zawartości m-PDCA-1 +, a takżekomórek o wysokiej zawartości CD11c.
Rysunek 4. Wzbogacanie komórek dendrytycznych za pomocą mikrokulek CD11c, separatora MiniMACS i dwóch kolumn MS.