Standaryzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płuc myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS

Podsumowanie

Dysocjacja komórek z określonych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać dużą liczbę żywotnych komórek zdolnych do hodowli. Dysocjator Miltenyi gentleMACS optymalizuje to zadanie dzięki prostemu i praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono sposób wykorzystania tego urządzenia w odniesieniu do tkanki płucnej.

Streszczenie

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanek jest istotnym warunkiem wstępnym dla wielu eksperymentów w badaniach nad komórkami. Proces dysocjacji całych narządów wymaga zastosowania specyficznych parametrów, aby w sposób powtarzalny uzyskać wysoką liczbę żywych komórek. Urządzenie gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu i praktycznemu protokołowi. Instrument posiada zaprogramowane ustawienia zoptymalizowane pod kątem wydajnej, a zarazem łagodnej dysocjacji różnych typów tkanek, w tym płuc myszy. W niniejszej publikacji zaprezentowano zastosowanie urządzenia gentleMACS Dissociator w odniesieniu do tkanki płucnej pochodzącej od myszy.

Protokół

Aby pracować w warunkach sterylnych, zaleca się wykonywanie wszystkich etapów w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

1. Materiały

1. Bufor HEPES: 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂)
2. Roztwór kolagenazy D: Kolagenaza D: 100 mg/mL (Kolagenaza D > 0.15 U/mg), w buforze HEPES
3. Roztwór DNazy I: 20 000 U/mL DNazy I
4. Bufor PBS o pH 7.2
5. Bufor PEB: 1 część roztworu zapasowego BSA w 20 częściach roztworu płuczącego autoMACS
6. Tkanka: płuco pochodzące od dorosłej samicy myszy BALB/C w wieku 6/7 tygodni, oczyszczone z przyległych narządów.
7. Opcjonalnie: CD11c MicroBeads, kolumny MACS MS, separator MACS do izolacji komórek dendrytycznych z zawiesiny pojedynczych komórek płuca myszy

2. Dysocjacja tkanki płucnej

1. Płucz tkankę w szalce Petri z PBS w celu usunięcia erytrocytów.
2. Przenieś maksymalnie 450 mg tkanki płucnej do probówki gentleMACS C Tube zawierającej 4,9 mL buforu HEPES.
3. Dodaj 100 μL roztworu kolagenazy D, aby uzyskać stężenie końcowe 2 mg/ml kolagenazy D.
4. Dodaj 10 μL roztworu DNazy I dla maksymalnie 150 mg tkanki (stężenie końcowe 40 U/ml DNazy I) lub 20 μL DNazy I dla 150-450 mg tkanki płucnej (stężenie końcowe 80 U/mL DNazy I).
5. Szczelnie zamknij probówkę C Tube i zamocuj ją w dysocjatorze gentleMACS. Następnie uruchom program „m_lung_01”.
6. Inkubuj przez 30 min w temperaturze 37°C przy automatycznej rotacji lub obracając probówkę ręcznie co 5 min.
7. Umieść próbkę z powrotem w dysocjatorze gentleMACS i uruchom program „m_lung_02”.

3. Filtracja

1. Przygotuj probówkę 50 mL do zbierania przefiltrowanych komórek, zastępując nakrętkę sitkiem komórkowym o rozmiarze oczek 70 μm.
2. Po zakończeniu drugiego programu gentleMACS można krótko odwirować probówkę w celu zebrania materiału próbki na dnie, w zależności od rozkładu materiału w probówce.
3. Pobierz komórki przez szczelną membranę nakrętki probówki C za pomocą odpowiedniej końcówki do pipety 1000 μl i nanieś je na sitko komórkowe.
4. Przemyj sitko komórkowe 5 ml buforu HEPES w RT.
5. Odwirowuj komórki w probówce 50 mL z prędkością 300xg przez 10 min, aby uzyskać osad.
6. Odsącz nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w pożądanej objętości buforu PEB.

Część 4: Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Dysocjacja płuc z użyciem dysocjatora gentleMACS™ pozwoliła na uzyskanie 92% żywych komórek. Martwe komórki zostały zabarwione fluorescencyjnie jodkiem propidyny (PI) (prawy wykres kropkowy; lewy wykres kropkowy: brak zabarwienia PI).

Rysunek 2. Dysocjacja tkanki płuc myszy przy użyciu systemu gentleMACS Dissociator skutkuje wysokim odsetkiem żywych leukocytów i komórek śródbłonka. Otrzymane zawiesiny jednokomórkowe barwiono przeciwciałami CD45-PE i CD146-FITC lub CD31-FITC, a następnie analizowano metodą cytometrii przepływowej.

Rycina 3. Zawiesina pojedynczych komórek uzyskana z tkanki płuc myszy została zabarwiona przeciwciałami CD11c-FITC oraz Anti-mPDCA-1-APC w celu wykrycia mysich plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych CD11c^low m-PDCA-1+ oraz komórek CD11c^high.

Rycina 4. Wzbogacenie komórek dendrytycznych przy użyciu CD11c MicroBeads, separatora MiniMACS i dwóch kolumn MS.

Dyskusja

W tym filmie przedstawiamy nową metodę dysocjacji tkanki płuc myszy. Wykazujemy, że połączenie obróbki mechanicznej i enzymatycznej tkanki płucne pozwoliło na uzyskanie wysokiego odsetka żywotnych leukocytów oraz komórek śródbłonka. W szczególności dezintegracja mechaniczna tkanki została przeprowadzona za pomocą urządzenia gentleMACS Dissociator. Probówki gentleMACS C Tubes zawierają system rotor-stator, który dysocjuje tkankę w sposób łagodny. Procedura jest sterowana przez ustawienia programu urządzenia. Parametry zos...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki C Tube	Miltenyi Biotec	Nr katalogowy 130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ Zestaw startowy	Miltenyi Biotec	Nr zamówienia 130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Rotator do probówek	Miltenyi Biotec	Nr zamówienia 130-090-753	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ roztwór płuczący	Miltenyi Biotec	Nr kat. 130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® roztwór zapasowy BSA	Miltenyi Biotec	Nr zamówienia 130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeads	Miltenyi Biotec	Nr zamówienia 130-052-001	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PE	Miltenyi Biotec	Nr zamówienia 130-092-026130-091-830	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APC	Miltenyi Biotec	Nr zamówienia 130-091-963	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITC	Miltenyi Biotec	Nr zamówienia 130-092-026	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PE	Miltenyi Biotec	Nr katalogowy 130-091-610	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
Roztwór jodku propidyny	Miltenyi Biotec	Nr zamówienia 130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Końcówki do pipet z wydłużonym zasięgiem Art 1000	Molecular BioProducts	Nr zamówienia 2079	http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61 0,15 U/mg) w buforze HEPES Roztwór DNazy I: 20 000 U/ml DNazy I Bufor PBS o pH 7,2 Bufor PEB: 1 część roztworu zapasowego BSA w 20 częściach roztworu płuczącego autoMACS Tkanka: płuco pobrane od dorosłej samicy myszy BALB/C w wieku 6/7 tygodni, oczyszczone z przyległych narządów. Opcjonalnie: CD11c MicroBeads, kolumny MACS MS, separator MACS do izolacji komórek dendrytycznych z zawiesiny pojedynczych komórek płuca mysiego. 2. Dysocjacja tkanki płucnej Opłukać tkankę w naczyniu Petriego zawierającym PBS w celu usunięcia erytrocytów. Przenieść maksymalnie 450 mg tkanki płucnej do probówki gentleMACS C Tube zawierającej 4,9 ml buforu HEPES. Dodać 100 μl roztworu kolagenazy D do uzyskania stężenia końcowego 2 mg/ml kolagenazy D. Dodać 10 μl roztworu DNazy I dla ilości tkanki do 150 mg (stężenie końcowe 40 U/ml DNazy I) lub 20 μl DNazy I dla 150–450 mg tkanki płucnej (stężenie końcowe 80 U/ml DNazy I). Szczelnie zamknąć probówkę C Tube i zamocować ją w dysocjatorze gentleMACS. Następnie uruchomić program „m_lung_01”. Inkubować przez 30 min w temperaturze 37°C przy automatycznej rotacji lub ręcznym obracaniu co 5 min. Umieścić próbkę ponownie w dysocjatorze gentleMACS i uruchomić program „m_lung_02”. 3. Filtracja Przygotować probówkę 50 ml do zbierania przefiltrowanych komórek, zastępując zakrętkę sitkiem komórkowym o rozmiarze oczek 70 μm. Po zakończeniu drugiego programu gentleMACS, w zależności od rozkładu materiału w probówce, można krótko odwirować probówkę, aby zebrać materiał na dnie. Pobrać komórki przez szczelną membranę zakrętki probówki C Tube za pomocą odpowiedniej końcówki do pipety 1000 μl i nanieść je na sitko komórkowe. Przemyć sitko komórkowe 5 ml buforu HEPES w temperaturze pokojowej. Odwirować komórki w probówce 50 ml przy 300xg przez 10 min do uzyskania osadu. Odessać supernatat i resuspender osad komórkowy w pożądanym objętości buforu PEB. Część 4: Reprezentatywne wyniki Rysunek 1. Dysocjacja płuc za pomocą dysocjatora gentleMACS™ pozwoliła uzyskać 92% żywych komórek. Komórki martwe zabarwiono fluorescencyjnie jodkiem propidyny (PI) (wykres kropkowy po prawej; wykres kropkowy po lewej: bez barwienia PI). Rysunek 2. Dysocjacja tkanki płucnej myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS skutkuje wysokim odsetkiem żywych leukocytów i komórek śródbłonkowych. Otrzymane zawiesiny pojedynczych komórek zabarwiono przeciwciałami CD45-PE i CD146-FITC lub CD31-FITC, a następnie poddano analizie w cytometrii przepływowej. Rysunek 3. Zawiesina pojedynczych komórek pochodząca z tkanki płucnej myszy została zabarwiona przeciwciałami CD11c-FITC i Anti-mPDCA-1-APC w celu wykrycia mysich plazmocytoidalnych komórek DC CD11clow m-PDCA-1+ oraz komórek CD11chigh. Rysunek 4. Wzbogacenie komórek dendrytycznych przy użyciu CD11c MicroBeads, separatora MiniMACS i dwóch kolumn MS.>http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html