Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W obrębie układu nerwowego opisano setki typów komórek neuronalnych i glejowych. Każdy konkretny typ komórek w mózgu lub rdzeniu kręgowym posiada zestaw cząsteczek powierzchniowych, czyli determinantów molekularnych, dzięki którym można go zidentyfikować i scharakteryzować. Obecnie skuteczne technologie identyfikacji i separacji komórek wymagają generowania preparatów jednokomórkowych przy jednoczesnym ograniczeniu śmierci komórek oraz niszczenia charakterystycznych białek powierzchniowych. Urządzenie gentleMACS Dissociator, stosowane w połączeniu z zestawami do dysocjacji opartymi na trypsynie lub papainie, pozwala na efektywną i łagodną dysocjację tkanki mózgowej, zachowując jednocześnie epitopy antygenowe i ograniczając utratę komórek. Standaryzowane przygotowanie zawiesin jednokomórkowych uzyskuje się przy użyciu probówek C Tubes oraz zoptymalizowanych, wstępnie zaprogramowanych programów gentleMACS. Po przygotowaniu zawiesiny jednokomórkowe można poddać działaniu koniugatów monoklonalnych, takich jak Anti-Prominin-1 MicroBeads, które identyfikują progenitory neuronalne, lub poddać dalszemu oczyszczaniu przy użyciu Myelin Removal Beads.
Protokół
Aby pracować w warunkach sterylnych, zaleca się wykonywanie wszystkich etapów w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
1. Materiały
- Zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej (P) (Składniki: Roztwory 1, 2, 3 i 4, bufor do przechowywania)
- Filtry do wstępnej separacji
- (Opcjonalnie) Kuleczki do usuwania mieliny
- Beta-merkaptoetanol
- Dysocjator gentleMACS
- Probówki typu C
- Rotator do probówek MACSmix
- HBSS (bez białek)
- HBSS (z białkami)
- Przed rozpoczęciem protokołu przygotować następujące roztwory:
- Zbuforowany roztwór soli Hanksa bez kationów dwuwartościowych Ca2+ lub Mg2+ (HBSS (w/o)
- Standardowy HBSS, tzn. z Ca2+ i Mg2+ (HBSS (w)
- W zależności od epitopu antygenu będącego przedmiotem zainteresowania w kolejnych zastosowaniach, należy użyć zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej opartego na papainie (P) lub zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej opartego na trypsynie (T).
- Przygotować następujące roztwory z zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej:
- Roztwór 2: dodać beta-merkaptoetanol do stężenia 0,067 mM
- Roztwór 4: rozpuścić proszek w 0,7 ml buforu do przechowywania (Storage Buffer, dostarczony w zestawie), delikatnie wymieszać (nie wirować w wortexie)
- Mieszanka enzymatyczna 1 (Enzyme Mix 1): odmierzyć pipetą 1,9 mL roztworu 2 oraz 50 μl roztworu 1 (oba z zestawu) do probówki typu C i inkubować przez 10-15 min w 37 °C. Ilość ta jest wystarczająca do dysocjacji 400 mg tkanki mózgowej.
2. Dysocjacja tkanki nerwowej
- Zważ tkankę mózgu w probówce zawierającej 1 ml HBSS (bez Ca²⁺/Mg²⁺)
- Przenieś mózg myszy do probówki typu C zawierającej 1950 μL podgrzanej Mieszaniny Enzymatycznej 1. (UWAGA: protokół ten jest opracowany dla ≤ 400 mg, ale objętość roztworów można skalować, aby pomieścić do 1600 mg tkanki mózgu na jedną probówkę typu C)
- Umieść probówkę typu C w dysocjatorze gentleMACS i uruchom program „m_brain_01”.
- Inkubuj z rotacją (4 rpm przy użyciu rotatora probówek MACSmix) przez 15 min w temperaturze 37 °C.
- Umieść probówkę typu C w dysocjatorze gentleMACS i uruchom program „m_brain_02”.
- Podczas etapu dysocjacji przygotuj 30 μl Mieszaniny Enzymatycznej 2 na każde 400 mg tkanki, delikatnie mieszając 20 μl Roztworu 3 i 10 μl Roztworu 4.
- Dodaj Mieszaninę Enzymatyczną 2 do probówki typu C przez szczelną septę w nakrętce i delikatnie wymieszaj bez użycia vortexa.
- Inkubuj probówkę typu C z rotacją przez 10 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
- Umieść probówkę typu C w dysocjatorze gentleMACS i uruchom program „m_brain_03”.
- Inkubuj probówkę typu C z rotacją przez 10 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
- Krótko odwiruj próbkę, aby zebrać ją na dnie probówki.
3. Filtracja
- Wybierz filtr o rozmiarze porów wystarczająco dużym, aby umożliwić przejście interesujących nas komórek. Na przykład komórki Purkinjego są zbyt duże, aby przejść przez filtr 30 μm, natomiast komórki Prominin-1+ przejdą.
- Za pomocą odpowiedniej pipety 1000 μl pobierz komórki z rurki C przez zamkniętą septem zakrętkę i przenieś je na filtr wstępny zamocowany na probówce zbiorczej o pojemności 15 ml. (UWAGA: w przypadku większych próbek należy użyć probówki zbiorczej o pojemności 50 ml).
- Przemyj filtr 10 ml HBSS (w).
- Odwiruj przefiltrowane komórki przy 300 x g przez 10 min w RT.
- Resuspender supernatant w wybranym medium lub buforze do dalszych zastosowań.
- W celu usunięcia szczątków mieliny zastosuj kuleczki do usuwania mieliny (Myelin Removal Beads).
4. Reprezentatywny wynik: Patrz rysunki 1-3
Rysunek 1 Dysocjacja mózgu przy użyciu urządzenia gentleMACS Dissociator pozwoliła uzyskać 97% żywych komórek, co wykazuje analiza cytometryczna.
Rysunek. 2 Zdjęcie z mikroskopu świetlnego przedstawiające tworzenie neurosfer po magnetycznej separacji komórek z użyciem MicroBeads Anti-Prominin-1 po 7 dniach hodowli w MACS® NeuroMedium z dodatkiem MACS Supplement B27 PLUS. Komórki przygotowano z mózgu myszy CD1 (P3) przy użyciu Neural Tissue Dissociation Kit (P).
Rysunek 3 Szczątki mieliny w zawiesinach pojedynczych komórek znacznie utrudniają izolację komórek, a usuwanie szczątków mieliny za pomocą kulek Myelin Removal Beads zwiększa wydajność separacji komórek. W przypadku separacji MACS z użyciem kulek Anti-Prominin-1 MicroBeads, mózg myszy P22 został rozdzielony przy użyciu zestawu Neural Tissue Dissociation Kit (P). Komórki z zawiesiny pojedynczych komórek zostały albo bezpośrednio użyte do separacji, albo poddane usuwaniu mieliny za pomocą Myelin Removal Beads. Porównanie separacji z próbek bez i z usuwaniem mieliny wykazuje, że czystość jest wyższa w przypadku próbek po uprzednim usunięciu mieliny.
Dyskusja
Urządzenie gentleMACS Dissociator umożliwia standaryzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanek nerwowych w systemie zamkniętym. Zestawy do dysocjacji tkanki nerwowej (Neural Tissue Dissociation Kits) zostały zoptymalizowane pod kątem zachowania epitopów antygenowych niezbędnych do dalszych zastosowań, takich jak barwienia immunocytochemiczne i immunomagnetyczna separacja komórek1-5. W niniejszym protokole przedstawiamy łagodną dysocjację enzymatyczną mózgu myszy przy użyciu urządzenia gentleMACS Dissociator oraz zestawu Neural Tissue Dissociation Kit (P), co pozwala uzyskać komórki o żywotności 97%. Z 100 mg tkanki nerwowej uzyskuje się od 5x106 do 1x107 komórek, w zależności od wieku tkanki gospodarza. Docelowe komórki Prominin-1+ zostały wyizolowane przy użyciu Anti-Prominin-1 MicroBeads, a następnie poddane hodowli. Wykazano, że protokół jest jeszcze bardziej skuteczny przy dodatkowym zastosowaniu Myelin Removal Beads podczas pracy z tkanką nerwową myszy w wieku >P7.
Oświadczenia
Autorzy są pracownikami firmy Miltenyi Biotec GmbH, Niemcy.
Materiały
Bibliografia
- Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons. Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).
- Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
- Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis. FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).
- Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases. Immunity. 29, 79-89 (2008).
- Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
Przedruki i uprawnienia
