Wytwarzanie eksperymentalnych tętniaków aorty brzusznej u myszy z wykorzystaniem elastazy

Podsumowanie

W niniejszym filmie pokazano, jak indukować tętniaki aorty brzusznej (AAA) u myszy poprzez przejściową infuzję wewnątrznaczyniową elastazy trzustkowej pochodzenia świńskiego do odcinka podnerkowego aorty brzusznej. Model ten pozwala na uzyskanie szerokiego wglądu w patobiologię AAA dzięki dostępności licznych myszy transgenicznych i z nokautem genowym.

Streszczenie

Przejściowa infuzja wewnątrzdzeniowa elastazy trzustkowej świni do odcinka podnerkowego aorty brzusznej jest najszerzej stosowanym modelem zwierzęcym tętniaka aorty brzusznej (AAA) od czasu, gdy została po raz pierwszy opisana u szczurów przez Anidjara i współpracowników.¹ Uzasadnienie dla jej opracowania opierało się na zaobserwowanym w tętniakach AAA zaburzeniu struktury elastyny. Ten model szczurzy został zmodyfikowany w celu wywołania AAA w regionie podnerkowym aorty u myszy.² Model ten pozwala na uzyskanie szerokiego wglądu w patobiologię AAA dzięki pojawieniu się licznych myszy transgenicznych i z nokautem genów. Ponadto stanowi on praktyczną platformę do testowania potencjalnych środków terapeutycznych na AAA. W tym filmie prezentujemy procedurę wywoływania AAA poprzez infuzję elastazy stosowaną w naszym laboratorium.

Myszy znieczula się 2,5% izofluranem, a następnie w warunkach sterylnych wykonuje się laparotomię. Aortę brzuszną izoluje się przy użyciu stereomikroskopu operacyjnego (Leica). Po założeniu tymczasowych podwiązań wokół proksymalnego i dystalnego odcinka aorty, za pomocą czubka igły o rozmiarze 30G wykonuje się aortotomię w miejscu rozwidlenia. Przez miejsce aortotomii wprowadza się i mocuje segment rurki polietylenowej PE-10 o zwężonym termicznie końcu. Następnie światło aorty perfunduje się przez 5-15 minut pod ciśnieniem 100 mm Hg solą fizjologiczną zawierającą porcine pancreatic elastase typu I (4,5 U/mL; Sigma Chemical Co.). Po usunięciu cewnika do perfuzji miejsce aortotomii zszywa się, dbając o to, aby nie zwęzić światła naczynia.

Protokół

1. Myszy znieczula się wziewnie izofluranem w stężeniu 2.0-3.0ml/L.
2. Brzuch zostaje ogolony i oczyszczony za pomocą alkoholu oraz betadyny.
3. Myszy kładzie się na plecach w polu operacyjnym.
4. Operator zakłada sterylne rękawiczki, a używane instrumenty są sterylizowane w sterylizatorze koralikowym.
5. Wykonuje się długie cięcie w linii środkowej brzucha. Zawartość jamy brzusznej zostaje odsunięta na zewnątrz za pomocą sterylnej gazy, aby odsłonić aortę brzuszną.
6. Aortę brzuszną izoluje się od poziomu lewej żyły nerkowej aż do rozwidlenia.
7. Odgałęzienia aorty brzusznej zostają odsłonięte i podwiązane szwem 10-0. Podwiązuje się wszystkie odgałęzienia aorty znajdujące się w odległości 1.0cm od rozwidlenia.
8. Tymczasowe ligatury z jedwabiu 6.0 zostają umieszczone wokół proksymalnej i dystalnej części aorty.
9. W miejscu rozwidlenia, za pomocą igły 30G, wykonuje się aortotomię.
10. Przez aortotomię wprowadza się rurkę polietylenową (PE-10) o zwężonym termicznie końcu, którą następnie mocuje się wiązaniem.
11. Używając worka z solą fizjologiczną zawieszonego na wysokości 136 cm w celu kalibracji do 100 mmHg, aortę wypełnia się solą fizjologiczną zawierającą 4.5 U/mL porcine pancreatic elastase typu I. Podczas 5-15 minutowej perfuzji elastazą aorta zazwyczaj rozszerza się do 150-170% swojej pierwotnej średnicy.
12. Następnie usuwa się cewnik perfuzyjny, a aortotomię zamyka się szwem 10-0, aby uniknąć zwężenia.
13. Po zamknięciu aortotomii usuwa się ligaturę dystalną.
14. Jeśli z naprawionej aortotomii nie występuje krwawienie lub jest ono minimalne, usuwa się ligaturę proksymalną. Rozszerzona aorta natychmiast wypełnia się krwią.
15. Jelit zostaje przywrócone do jamy brzusznej, a ranę zamyka się dwuwarstwowo szwem nylonowym lub polipropylenowym 6-0.
16. Na ranę nanosi się krople 0.25% Bupivicaime (około jednej kropli na każdy centymetr długości cięcia), a podskórnie podaje się jedną dawkę Caprofen (5mg/kg).
17. Myszy umieszcza się w ciepłym miejscu; zazwyczaj budzi się ona w ciągu 15 minut.

    Rycina 1.Reprezentatywny wynik AAA indukowanej elastazą.

Dyskusja

Wcześniejsze badania wskazały na znaczną zmienność między partiami w rozwoju AAA przy użyciu różnych komercyjnych preparatów elastazy³. Dlatego kluczowe jest monitorowanie partii produkcyjnych oraz stosowanie odpowiednich grup kontrolnych, aby udokumentować zdolność preparatu do indukowania AAA.

Co ciekawe, podatność na rozwój AAA w tym modelu zależy od użytej szczepu myszy³. Mysz wykorzystana w niniejszym materiale wideo należy do szczepu C57Bl/6, u którego przy zastoso...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Elastaza trzustkowa świńska typu I	Odczynnik	Sigma-Aldrich	E1250
rurki polietylenowe (PE-10)		BD Biosciences	427400
CHANGE-A-TIP		Bovie Medical Corporation	18010-00 (FST)	nóż do kauteryzacji
LEICA MZ6		Leica Microsystems		stereomikroskop
LEICA DFC290HD		Leica Microsystems		kamera USB
Image Pro Express wersja 6.0		Media Cybernetics Inc.		oprogramowanie