$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Immunohistochemia jest jedną z najczęściej używanych technik do charakteryzowania ekspresji białek w mózgu różnych eksperymentalnych modeli zwierzęcych. Stosunkowo łatwo jest przeprowadzić systematyczne procedury immunohistochemiczne na mózgach gryzoni i innych powszechnych modelach eksperymentalnych o podobnej wielkości mózgu. Jednak według naszej wiedzy nie ma żadnej opublikowanej pracy, która zawierałaby wyczerpujący opis tego, jak przeprowadzić takie procedury immunodetekcji w całym mózgu małpy. Poniżej znajduje się szczegółowy opis, jak przygotować cały mózg małpy do immunohistochemicznej detekcji różnych białek docelowych na dużą skalę. Praca ta powstała w wyniku współpracy między przedsięwzięciami komercyjnymi i akademickimi. W związku z tym szczegóły dotyczące osadzania tkanek i ich sekcji pozostają zastrzeżoną wiedzą NSA.
Część 1: Leczenie zwierząt i przygotowanie tkanek
Mózg dorosłej małpy koczkodanu (Cercopithecus aethiops) jest używany do niniejszego protokołu. Wszystkie procedury są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Canadian Council on Animal Care (CCAC) dotyczącymi wykorzystywania i opieki nad zwierzętami w badaniach biomedycznych1.
- Zwierzę jest głęboko uspokojone chlorowodorkiem ketaminy (10 mg/kg, i.m.), usypywane za pomocą przedawkowania pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, i.v.) i perfundowane przezsercowo 0,1 M PBS aż do całkowitego wykrwawienia.
- Następnie podaje się 4% roztwór paraformaldehydu w PBS przez 5 minut (~1 litr).
- Eksternalizację mózgu umieszcza się w stopniowanych roztworach sacharozy buforowanych PBS (kolejno 10, 20 i 30%) zawierających 0,02% azydku sodu i utrzymuje w temperaturze 4°C, aż mózg opadnie na dno pojemnika. Roztwór wymienia się co kilka dni, aż mózg zostanie poddany zamrożeniu.
- Mózg jest wysyłany do NeuroScience Associates (NSA; Knoxville, TN) zostaną poddane opatentowanej technologii osadzania i zamrażania MultiBrain™.
- Siedem (7) punktów orientacyjnych wyrównania jest umieszczanych w macierzy osadzania, dzięki czemu sekcje mogą być prawidłowo zorientowane (tj. orientacja lewo-prawo) i ponownie wyrównane po zakończeniu przetwarzania histologicznego.
- Zamrożony blok jest fotografowany cyfrowo na powierzchni bloku przed pobraniem każdego odcinka szeregowego z bloku. Obrazy cyfrowe, a także wycinki z tego mózgu, mogą być później wykorzystane do rekonstrukcji 3D map anatomicznych i histologicznych.
- Szeregowe swobodnie unoszące się skrawki koronalne, o grubości 50 μm na sekcję, są pobierane z całego mózgu.
Część 2: Przetwarzanie histologiczne
Sekcje są wybierane w danym przedziale przestrzennym (np. 500 μm) i dla naszych celów eksperymentalnych były przetwarzane z następującymi przeciwciałami: kruche białko upośledzenia umysłowego X (FMRP; Chemik; Temecula, Kalifornia), SMI32 (Sternberger Monoclonals Inc.; Baltimore, MD) i NeuN (Chemicon; Temecula, Kalifornia). FMRP jest białkiem cytoplazmatycznym, które obficie występuje w neuronach normalnych i permutacyjnych mózgów nosicieli2. NeuN (jądra neuronalne) specyficznie rozpoznaje białko NeuN wiążące DNA, specyficzne dla neuronów, które jest obecne w większości neuronów i jest rozmieszczone w jądrach neuronalnych, perikarya i niektórych proksymalnych procesach neuronalnych3. SMI-32 jest przeciwciałem monoklonalnym, które rozpoznaje niefosforylowany epitop na białkach neurofilamentowych4.
- W odstępie 500 μm stosuje się około 140 skrawków na przeciwciało.
- Wszystkie etapy inkubacji, mycia i barwienia przeprowadza się z łagodnym mieszaniem przy użyciu specjalistycznych naczyń i koszy do barwienia (HistoTools; Knoxville, Tennessee).
- Sekcje są najpierw inkubowane w roztworze zawierającym 0,1 M PBS/0,3% Triton X-100 (TX)/5% normalnej ochrypłej surowicy (NHS) przez 60 minut w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania cząsteczek przeciwciała i wynikającego z tego barwienia tła.
- Skrawki oznaczone do barwienia immunologicznego FMRP przechodzą dodatkowy etap odzyskiwania antygenu przy użyciu Roztworu do Demaskowania Antygenu (Vector Labs; Burlingame, CA) zgodnie z instrukcjami sprzedawcy.
- Sekcje są następnie inkubowane przez noc i w oddzielnych dniach w odpowiednich roztworach przeciwciał zawierających 0,1 M PBS / 0,3% TX / 3% NHS (ze współczynnikiem rozcieńczenia 1/5 000 dla FMRP i SMI-32 oraz 1/2 000 dla przeciwciał NeuN).
- Następnego dnia skrawki myje się przez trzy 10-minutowe okresy w roztworze myjącym (0,1 M PBS / 0,3% TX), a następnie inkubuje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w biotynylowanym przeciwciałie wtórnym przeciwko myszom wyhodowanym u koni (Vector Labs; rozcieńczenie 1/1 000 w 0,1 M PBS / 0,3% TX / 3% NHS).
- Po kolejnym zestawie 3 10-minutowych płukań, skrawki umieszcza się w roztworze kompleksu peroksydazy chrzanowej sprzężonej z awidyną i biotyną (Vector Labs) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Wreszcie, po kolejnym cyklu płukania, skrawki są poddawane przez 10 minut reakcji diaminobenzydyny wzmocnionej niklem (Ni-DAB), która wytwarza ciemnoniebieskie zabarwienie w neuronach immunoreaktywnych.
- Po zakończeniu procedury histologicznej skrawki są montowane na szkiełkach szklanych pokrytych żelatyną.
- Wszystkie sekcje są suszone na powietrzu przez noc i przykrywane zgodnie ze standardowymi procedurami.
Część 3: Reprezentatywne wyniki:
Ta metoda tworzy kompletny profil ekspresji interesującego białka docelowego w całym mózgu małpy. Tutaj pokazujemy reprezentatywne odcinki koronalne, które zapewniają migawkę ekspresji FMRP, NeuN i SMI32 w tym samym mózgu małpy.
Rysunek 1: Naczynie do barwienia (A) i kosz (B) używane do wielkoskalowego przetwarzania wsadowego swobodnie pływających sekcji do immunodetekcji.
Rysunek 2: Reprezentatywne przekroje koronalne mózgu koczkodanu wybarwionego na obecność przeciwciał FMRP (A), NeuN (B) i SMI32 (C).