Wielkoskalowa immunodetekcja białek docelowych w całym mózgu naczelnych jest możliwa dzięki zastosowaniu nowatorskich metod zatapiania i krojenia tkanek w połączeniu z wykorzystaniem innowacyjnego urządzenia do masowego barwienia wielu wolnopływających skrawków jednocześnie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Seryjne barwienie immunohistochemiczne do wielkoskalowej detekcji białek w całym mózgu małpy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Immunohistochemia (IHC) jest jedną z najszerzej stosowanych technik laboratoryjnych służących do wykrywania białek docelowychin situPytania dotyczące wzorca ekspresji białka docelowego w całym mózgu są stosunkowo łatwe do rozstrzygnięcia przy użyciu IHC w przypadku małych mózgów, takich jak mózgi gryzoni. Jednak udzielenie odpowiedzi na te same pytania w przypadku mózgów dużych i silnie sfałdowanych, takich jak mózgi naczelnych, wiąże się z szeregiem wyzwań. Przedstawiamy tutaj systematyczne podejście do immunodetekcji białek docelowych w mózgu dorosłej małpy. Metoda ta opiera się na metodologii zatapiania i krojenia tkanek opracowanej przez NeuroScience Associates (NSA), a także na narzędziach stworzonych specjalnie do barwienia seryjnego sekcji swobodnie pływających. Pozwala to na uzyskanie jednolitego barwienia zestawu sekcji, które w określonym odstępie reprezentują cały mózg. Tak zabarwione sekcje mogą być następnie poddane szerokiej gamie procedur analitycznych w celu pomiaru poziomów białek oraz określenia populacji neuronów wykazujących ekspresję danego białka.
Protokół
Immunohistochemia jest jedną z najszerzej stosowanych technik charakteryzacji ekspresji białek w mózgach różnych eksperymentalnych modeli zwierzęcych. Prowadzenie systematycznych procedur immunohistochemicznych w mózgach gryzoni i innych powszechnych modeli eksperymentalnych o podobnej wielkości mózgu jest stosunkowo łatwe. Jednakże, z naszej wiedzy nie istnieją publikacje, które stanowiłyby kompleksowy opis sposobu przeprowadzania takich procedur immunodetekcji w całym mózgu małpy. Poniżej znajduje się szczegółowy opis przygotowania całego mózgu małpy do wielkoskalowej detekcji immunohistochemicznej różnych białek docelowych. Praca ta powstała w wyniku współpracy sektora komercyjnego i akademickiego. W związku z tym szczegóły dotyczące zatapiania i krojenia tkanek pozostają wiedzą zastrzeżoną firmy NSA.
Część 1: Zabiegi u zwierząt i przygotowanie tkanek
W niniejszym protokole wykorzystano mózg dorosłej małpy z gatunku werwetka (Cercopithecus aethiops). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC) dotyczącymi wykorzystania i opieki nad zwierzętami w badaniach biomedycznych1.
- Zwierzę zostaje poddane głębokiej sedacji za pomocą hydrochlorku ketaminy (10 mg/kg, i.m.), uśpione przedawkowaniem pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, i.v.) i poddane perfuzji transkardialnej 0,1 M PBS aż do całkowitego upuśczenia krwi.
- Następnie stosuje się 4% roztwór paraformaldehydu w PBS przez 5 min (~1 litr).
- Wyjęty mózg umieszcza się w szeregowych roztworach sacharozy w buforze PBS (kolejno 10, 20 i 30%) zawierających 0,02% azotku sodu i przechowuje w temperaturze 4˚C, aż mózg opadnie na dno naczynia. Roztwór wymienia się co kilka dni, aż do momentu mrożenia i krojenia mózgu.
- Mózg jest przesyłany do firmy NeuroScience Associates (NSA; Knoxville, TN) w celu zastosowania ich zastrzeżonej technologii zatapiania i mrożenia MultiBrain™.
- W matrycy zatapiającej umieszcza się siedem (7) punktów orientacyjnych, aby możliwe było prawidłowe zorientowanie przekrojów (np. orientacja lewo-prawo) i ich ponowne wyrównanie po zakończeniu obróbki histologicznej.
- Zamrożony blok jest fotografowany cyfrowo na powierzchni czoła przed pobraniem każdego seryjnego przekroju z bloku. Obrazy cyfrowe oraz przekroje z tego mózgu mogą być później wykorzystane odpowiednio do rekonstrukcji 3D map anatomicznych i histologicznych.
- Z całego mózgu pobierane są seryjne, wolno pływające przekroje wieńcowe o grubości 50 µm na przekrój.
Część 2: Obróbka histologiczna
Przekroje wybierano w określonym odstępie przestrzennym (np. 500-µm) i na potrzeby naszych doświadczeń przetwarzano z zastosowaniem następujących przeciwciał: białka FMRP (fragile-X mental retardation protein; Chemicon; Temecula, CA), SMI32 (Sternberger Monoclonals Inc.; Baltimore, MD) oraz NeuN (Chemicon; Temecula, CA). FMRP jest białkiem cytoplazmatycznym, które występuje obficie w neuronach mózgów prawidłowych oraz osób będących nosicielami permutacji2. NeuN (Neuronal Nuclei) specyficznie rozpoznaje wiążące DNA białko NeuN specyficzne dla neuronów, które występuje w większości neuronów i jest rozmieszczone w jądrach neuronalnych, perykariach oraz w niektórych proksymalnych wypustkach neuronalnych3. SMI-32 jest przeciwciałem monoklonalnym, które rozpoznaje niefosforylowany epitop białek neurofilamentowych4.
- Przy odstępie 500 µm na jedno przeciwciało wykorzystuje się około 140 przekrojów.
- Wszystkie inkubacje, przemycia i etapy barwienia są przeprowadzane przy łagodnym mieszaniu z wykorzystaniem specjalistycznych naczyń i koszyków do barwienia (HistoTools; Knoxville, TN).
- Przekroje są najpierw inkubowane przez 60 min w roztworze zawierającym 0,1 M PBS/0,3% Triton X-100 (TX)/5% normal horse serum (NHS), aby zredukować niespecyficzne wiązanie cząsteczek przeciwciał i wynikające z tego barwienie tła.
- Przekroje przeznaczone do immunobarwienia FMRP poddawane są dodatkowemu etapowi odsłaniania antygenów przy użyciu Antigen Unmasking Solution (Vector Labs; Burlingame, CA) zgodnie z instrukcjami producenta.
- Następnie przekroje są inkubowane przez noc, w osobnych dniach, w odpowiednich roztworach przeciwciał zawierających 0,1 M PBS/0,3% TX/3% NHS (przy rozcieńczeniu 1/5 000 dla przeciwciał FMRP i SMI-32 oraz 1/2 000 dla przeciwciał NeuN).
- Następnego dnia przekroje są płukane trzykrotnie przez 10 min w roztworze do płukania (0,1 M PBS/0,3% TX), a następnie inkubowane przez 2 h w temperaturze pokojowej z biotynilowanym wtórnym przeciwciałem antymysim pochodzącym z konia (Vector Labs; rozcieńczenie 1/1 000 w 0,1 M PBS/0,3% TX/3% NHS).
- Po kolejnej serii trzech 10-minutowych płukań przekroje są umieszczane na 1 h w temperaturze pokojowej w roztworze kompleksu awidyna-biotyna sprzężonej z peroksydazą chrzanową (Vector Labs).
- Na koniec, po kolejnej serii płukań, przekroje są poddawane przez 10 min reakcji z diaminobenzydyną wzmocnioną niklem (Ni-DAB), co powoduje powstanie ciemnoniebieskiego barwnika w neuronach immunoreaktywnych.
- Po zakończeniu procedury histologicznej przekroje są montowane na szkiełkach przedmiotowych powlekanych żelatyną.
- Wszystkie przekroje są suszone na powietrzu przez noc i zakrywane szkiełkami cover-slip zgodnie ze standardowymi procedurami.
Część 3: Reprezentatywne wyniki:
Metoda ta pozwala na uzyskanie pełnego profilu ekspresji białka docelowego w całym mózgu małpy. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne przekroje czołowe, które obrazują ekspresję FMRP, NeuN oraz SMI32 w tym samym mózgu małpy.
Rysunek 1: Pojemnik do barwienia (A) oraz koszyczek (B) stosowane do wielkoskalowego przetwarzania partii wolnopływających skrawków w celu immunodetekcji.
Rycina 2: Reprezentatywne przekroje wieńcowe mózgu małpy werwet barwione przeciwciałami przeciwko FMRP (A), NeuN (B) i SMI32 (C).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej procedurze istnieją dwa krytyczne kroki, które umożliwiają detekcję białek na dużą skalę w całym mózgu małpy. Pierwszym jest protokół zatapiania i krojenia, który pozostaje wiedzą zastrzeżoną NSA. Drugim jest zastosowanie szalek i koszyczków do barwienia dostarczonych przez HistoTools. To drugie rozwiązanie pozwala na łatwą i szybką obsługę wielu (~40) skrawków jednocześnie. Zapewnia ono również możliwość jednolitego traktowania wszystkich przekrojów mózgu, co gwarantuje naukowo poprawną obróbkę histologiczn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Frankowi Ervinowi, Robercie Palmour oraz personelowi Behavioural Sciences Foundation Laboratories w St Kitts na Karaibach za nieustające wsparcie naszych badań nad naczelnymi. Praca ta była wspierana stypendium z Fragile X Research Foundation of Canada (FXRFC) przyznanym SZ oraz grantami operacyjnymi z Canadian Institutes of Health Research (AC) i National Engineering and Research Council of Canada (MP).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| przeciwciało monoklonalne anty-FMRP | Chemicon International | MAB2160 | Wymaga odmaskowania antygenu w utrwalonej tkance. |
| przeciwciało monoklonalne anty-NeuN | Chemicon International | MAB377 | N/D |
| przeciwciało monoklonalne anty-neurofilament H | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI32 | N/D |
| roztwór do odmaskowywania antygenów | Vector Laboratories | H-3300 | N/D |
| normalne surowica konia | Invitrogen | 16050122 | 500 mL |
| biotynylowane przeciwciało anty-mysie IgG (H+L), wytworzone u konia | Vector Laboratories | BA-2000 | |
| zestaw VECTASTAIN ABC (standardowy) | Vector Laboratories | PK-4000 | 1,5 mg |
| kuweta do barwienia pływających skrawków | HistoTools | 10009 | 12 x 65 mm |
| koszyk transportowy do barwienia | HistoTools | 10012 | duży (pasuje do kuwety 12 x 65 mm) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | P8514B | N/D |
| DAB | Fisher Scientific | AC11209-0050 | N/D |
Bibliografia
- Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).
- Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation. Nat Genet. 4, 335-340 (1993).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116, 201-211 (1992).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
