Przygotowanie bloku komórkowego z materiału cytologicznego z przewagą pojedynczo rozproszonych komórek

Podsumowanie

Metoda Shidhama przygotowania bloków komórkowych z markerem AV z preparatów cytologicznych zawierających pojedynczo rozproszone komórki i małe grupy komórek.

Streszczenie

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę Shidhama służącą do przygotowania bloków komórkowych z płynnych preparatów cytologicznych szyjki macicy i pochwy, zawierających pojedynczo rozproszone komórki oraz małe grupy komórek. Technika ta wykorzystuje HistoGel (Thermo Scientific) przy użyciu konwencjonalnego sprzętu laboratoryjnego.

Stosowanie bloków komórkowych jest cennym narzędziem pomocniczym w ocenie cytologii nieginekologicznej. Pozwalają one cytopatologowi na badanie dodatkowych szczegółów morfologicznych preparatu, w tym architektury zmiany. Co najważniejsze, umożliwiają one przeprowadzenie badań pomocniczych, takich jak immunocytochemia, testy hybrydyzacji in situ (FISH/CISH) oraz reakcja łańcuchowa polimerazy in situ (PCR). Tradycyjne techniki przygotowania bloków komórkowych były stosowane głównie w przypadku próbek cytologii nieginekologicznej, zazwyczaj w odniesieniu do wysięków z jam ciała oraz biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej.

Próbki szyjkowo-pochwowe w preparatach płynnych charakteryzują się względnie niższą komórkowością niż ich odpowiedniki nieginekologiczne, z wieloma pojedynczymi, rozproszonymi komórkami. Z tego powodu trudne jest uzyskanie odpowiedniej komórkowości w przekrojach bloku komórkowego. Ponadto histotechnik wykonujący skrawanie bloku nie jest w stanie zwizualizować poziomu, na którym komórki występują w najwyższym stężeniu. W konsekwencji utrudniony jest monitoring właściwego poziomu, z którego można wybrać skrawki do przeniesienia na szkiełka przedmiotowe w celu przeprowadzenia badań. W efekcie obszar bloku komórkowego zawierający komórki o znaczeniu diagnostycznym może zostać pominięty, albo poprzez zbyt głębokie cięcie, albo poprzez niewystarczające pogłębienie skrawania. Obecny protokół metody Shidhama rozwiązuje te problemy. Choć protokół ten jest zestandaryzowany i opisany dla ginekologicznych próbek cytologicznych w preparatach płynnych, może on zostać zastosowany również do próbek nieginekologicznych, takich jak płyny z wysięków, materiał z biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej (FNA), wymazy szczoteczkowe, zawartość cyst itp., w celu poprawy jakości materiału diagnostycznego w przekrojach bloku komórkowego.

Protokół

Wprowadzenie:

Niniejszy film opisuje metodę Shidhama dotyczącą przygotowania bloków komórkowych z próbek cytologii w płynnym medium (LBC) przy użyciu HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). W porównaniu z innymi przypadkowymi podejściami, dwie kluczowe cechy tego protokołu przygotowania bloków komórkowych z relatywnie hipokomórkowych próbek z pojedynczo rozproszonymi luźnymi komórkami (1-5) przedstawiają się następująco.

1. Niniejszy protokół obejmuje etapy koncentracji komórek w płaszczyźnie równoległej do powierzchni cięcia bloku komórkowego.
2. Zawiera on również przypominającą sygnał ciemny wtręt markera AV (Rysunek 1b), który służy dwóm z poniższych celów:
   1. Wizualizacji poziomu, na którym skoncentrowane są komórki. Obszar bloku komórkowego z poszukiwanymi komórkami może być teraz widoczny dla histotechnika w momencie odsłonięcia ciemnego markera podczas cięcia. Ta możliwość monitorowania zapobiega przecięciu poziomu z największą liczbą komórek lub zbyt powierzchownemu cięciu przed dotarciem do poziomu o najwyższym stężeniu komórek próbki.
   2. Służenia jako referencyjny punkt lokalizacji w seryjnych skrawkach bloku komórkowego na różnych slajdach. Punkt referencyjny ten działa jak znacznik pomagający zlokalizować konkretne komórki lub grupy komórek w celu oceny koordynacyjnego wzoru immunoreaktywności z zastosowaniem podejścia SCIP (6,7).

PROTOKÓŁ (Rysunek 2)

Przygotowanie próbki.

1. Przenieść pozostałości preparatu cytologicznego szyjki macicy w technice LBC do szklanej probówki o płaskim dnie (średnica 15 mm x 45 mm) (Rysunek 2.1 do 2.4). Umieścić szklaną probówkę w większej plastikowej probówce transportowej (28 x 85 mm) i poddać wirowaniu. Wyjąć szklaną probówkę z probówki transportowej i odlać nadsącz.
2. Następnie szklaną probówkę należy zakapslować (aby zapobiec przedostaniu się gorącej wody w kolejnym kroku) i ponownie umieścić w większej plastikowej probówce transportowej o płaskim dnie.
3. Plastikową probówkę transportową zawierającą szklaną probówkę należy zakapslować, umieścić w wirówce (z ruchomymi uchwytami, a nie z uchwytami o stałym kącie, aby komórki opadały prostopadle na płaskie dno szklanej probówki) i wirować z siłą 1805 G (3000 obr./min, promień rotora 17 cm) przez pięć minut (Rysunek 2.5).
4. Następnie probówki należy wyjąć pionowo z wirówki, a mniejszą szklaną probówkę wyciągnąć pęsetą z większej plastikowej probówki transportowej, uważając, aby nie naruszyć osadu z komórkami.
5. Zdjąć kapsel z szklanej probówki z preparatem i odlać nadsącz, dbając o to, aby nie naruszyć płaskiej warstwy osadu komórkowego na dnie (Rysunek 2.6).

Umieszczenie referencyjnego markera współrzędnych AV i dodanie żelu

1. Ciemny marker AV-marker (o rozmiarze około 2 mm x 2 mm, płaskiej powierzchni, będący fragmentem ciemnego, możliwością cięcia materiału) (Rycina 3) zostaje dodany jako punkt orientacyjny do szklanej probówki (Rycina 2.7).
2. Upłynnia się alikwot HG, topiąc go w mikrofalówce przez 10 sekund przy średniej mocy.
3. Do probówki dodaje się 0,5 ml stopionego HG, szybko miesza z osadem i zakręca (Rycina 2.8) (Należy szybko przejść do następnego kroku, nie dopuszczając do rozpoczęcia krzepnięcia HG).
4. Do plastikowej probówki przenoszącej dodaje się około 2,5 ml ciepłej (45° C) wody (Rycina 2.9).
5. Mniejsza, zakręcona szklana probówka jest umieszczana wewnątrz plastikowej probówki z ciepłą wodą. (Krok ten jest niezbędny, aby zapobiec krzepnięciu HG podczas kolejnych etapów) (Rycina 2.9).
6. Plastikową probówkę przenoszącą umieszcza się w wirówce (z ruchomymi uchwytami, a nie o stałym kącie, aby komórki opadały prostopadle do płaskiego dna szklanej probówki) i wiruje przy 1805 G (3000 rpms, promień rotora 17 cm) przez pięć minut. Celem tego etapu wirowania jest przesunięcie markera AV oraz skoncentrowanie komórek w warstwie bliższej powierzchni cięcia końcowego bloku komórkowego zatopionego w parafinie (Rycina 1d).
7. Probówki są następnie ostrożnie i pionowo wyjmowane z wirówki, uważając, aby nie zakłócić osadzonej cienkiej warstwy z komórkami próbki na dnie.
8. Odkręca się większą plastikową probówkę i wyjmuje pionowo mniejszą szklaną probówkę za pomocą pęsety, nie naruszając warstwy osadu z komórkami preparatu.
9. Małą szklaną probówkę chłodzi się w pozycji pionowej przez 15 minut w lodówce, aby schłodzić i utwardzić HG (Rycina 2.11).

Usunięcie bloku komórkowego w postaci grudki żelu z preparatem do dalszej obróbki

1. Stężały dysk HG z warstwą skoncentrowanego/osadzonego materiału na dnie zostaje oddzielony od szklanej probówki z płaskim dnem poprzez wtryskiwanie 10% formaliny za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 23 G (Rycina 2.12).
2. Igłę wprowadza się wzdłuż ścianki probówki, na obrzeżach stężałego dysku HG z materiałem (Rycina 2.12).
3. Igłę obraca się wzdłuż ścianki probówki, powoli podając formalinę przez strzykawkę. Powoduje to oddzielenie od płaskiego dna szklanej probówki tzw. guzika HG wraz z ciemnym markerem AV oraz skoncentrowanym w nim materiałem (Rycina 2.12).
4. Blok komórkowy (żelowy guzik z komórkami materiału) zostaje następnie umieszczony w opisanej kasecie i przekazany do procesowania tkanek w celu przygotowania bloków komórkowych zatopionych w parafinie (Rycina 2.13).

Zalewanie i cięcie preparatu

1. Dysk zostaje zatopiony w parafinie z ciemnym znacznikiem orientacyjnym skierowanym w dół jako powierzchnia cięcia (Rysunek 1).
2. Blok jest skrawany do momentu, aż ciemny AV-marker pełniący rolę znacznika zostanie odsłonięty i stanie się wyraźnie widoczny.
3. Z tego poziomu, który powinien zawierać większość pojedynczo rozproszonych komórek z próbki, wycina się skrawki o grubości trzech do czterech mikronów.
4. Skrawki są zbierane na szkiełkach przedmiotowych do dalszego barwienia, barwienia immunohistochemicznego lub innych wskazanych testów. Protokoły tych testów, w tym rodzaj szkiełek stosowanych do montowania skrawków, mogą się różnić. Zazwyczaj do immunobarwienia stosuje się szkiełka powlekane, aby zapobiec pływaniu i utracie skrawków podczas etapów immunobarwienia.

Stosowane skróty (w kolejności alfabetycznej): CISH, testy chromogenicznej hybrydyzacji in situ; FISH, testy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ; FFPE, utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie; FNA, cienkoigłowa aspiracja; HG, HistoGel™ (Thermo Scientific); LBC, cytologia w materiale w płynie; PCR, reakcja łańcuchowa polimerazy;

 

Rycina 1. Struktura bloku komórkowego przygotowanego zgodnie z protokołem Shidhama.

Rycina 2. Podsumowanie poszczególnych etapów przygotowania bloku komórkowego z materiału LBC zgodnie z protokołem Shidhama.

Rycina 3. Przygotowanie markerów AV ze skórek bananów.

Rycina 4. Porównanie bloków komórkowych i przekrojów z markerem AV oraz bez niego.

Rycina 5. Porównanie komórkowości przekrojów bloku komórkowego z markerem AV i bez markera AV.

Dyskusja

Bloki komórkowe stanowią cenne narzędzie do oceny różnych preparatów cytologicznych (1). Co najważniejsze, oprócz szczegółów architektonicznych preparatu, bloki komórkowe umożliwiają przeprowadzenie badań dodatkowych, takich jak immunocytochemia, testy fluorescencyjnej/chromogennej hybrydyzacji in situ (FISH/CISH) oraz PCR in situ. Opisano wiele metod przygotowywania bloków komórkowych. Większość z nich jest jednak odpowiednia dla nieginekologicznych preparatów cytologicznych, które zawierają stosunkowo dużo komórek oraz mikrofragmenty tkanek, na przykład w aspiratach FNA oraz w niektórych płynach surowiczych, takich jak wysięki (1,3,4,5).

Ponieważ bloki komórkowe zapewniają przede wszystkim możliwość oceny immunocytochemicznej, ich opracowanie powinno być możliwie najbliższe procedurom stosowanym dla tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE). Ostatecznie wyniki uzyskane po ocenie immunocytochemicznej przekrojów bloków komórkowych są porównywane z wynikami z literatury przedmiotu, opracowanymi głównie na podstawie przekrojów tkanek FFPE. Wszelkie zmiany w protokole mogą potencjalnie zaburzyć i unieważnić wiarygodność wyników uzyskanych z bloków komórkowych opracowanych przy użyciu innych utrwalaczy i sekwencji odczynników niż te stosowane w rutynowym badaniu FFPE. Niektóre techniki komercyjne mogą mieć wadę polegającą na opracowaniu zgodnie z protokołem zakładającym ekspozycję na inne utrwalacze i odczynniki.

Dla próbek zawierających znaczną ilość osadu i fragmentów tkanki dostępne są różne metody przygotowania bloków komórkowych. Co do zasady, skoncentrowane osady są stabilizowane za pomocą odpowiedniego żelu lub czynnika koagulującego. Następnie tak przygotowany materiał, po opracowaniu analogicznie do próbek patomorfologicznych lub biopsji, zostaje zatopiony w parafinie.

Stosowane żele obejmują żelatynę, agar, fibrynogen/osocze-trombinę oraz inne żele komercyjne, takie jak HG. Metody zagęszczania różnią się – od prostego wytrącania osadu przez wirowanie, po koncentrację komórek wzdłuż różnych rodzajów membran. Przykłady obejmują: filtry Milipore, worki kollodynowe (Celloidin) lub zeskrobywanie komórek z rozmazów cytologicznych na szkiełkach (1). Oceniliśmy również różnorodne żele, testując różne kombinacje agaru i żelatyny. Żadna z kombinacji nie pozwoliła na uzyskanie konsystencji wystarczająco stabilnej, aby otrzymać w jednym kawałku łatwo manipulowany krążek zestalonego żelu z zatopionymi komórkami z próbki. Żel HG wykazał odpowiednią konsystencję i w naszym doświadczeniu wyniki barwienia immunohistochemicznego na przekrojach bloków komórkowych HG były doskonałe.

Próbki do cytologii w płynie (LBC) pobierane do cytologii szyjkowo-pochwowej są zazwyczaj mniej komórkowe niż próbki nieginekologiczne, o czym wspomniano powyżej. Ponadto ginekologiczne próbki LBC zawierają przede wszystkim pojedyncze, rozproszone złuszczone komórki powierzchniowe błony śluzowej szyjkowo-pochwowej. Z tego powodu w przekrojach bloków komórkowych może nie zostać osiągnięta odpowiednia komórkowość bez zastosowania specjalnej metody. Ponieważ te pojedynczo rozproszone elementy komórkowe w bloku nie są widoczne dla histotechnika podczas skrawania, poziom, na którym komórki zaczynają pojawiać się w przekrojach, nie może być dostrzeżony i może zostać pominięty — albo poprzez wycięcie poziomu z największą liczbą komórek, albo poprzez niewystarczająco głębokie cięcie do poziomu o najwyższym stężeniu komórek próbki (Rysunek 4). Protokół Shidhama rozwiązuje oba te problemy, wykorzystując HG jako medium do zatopienia oraz konwencjonalny sprzęt laboratoryjny (2) (Rysunek 2).

Protokół ten obejmuje dwie główne cechy (Rysunek 1):

1. Koncentracja i wyrównanie pojedynczo rozproszonych komórek w wąskiej płaszczyźnie sąsiadującej i równoległej do powierzchni cięcia bloku komórkowego (Rysunek 5).
2. Włączenie ciemnego markera AV pełniącego funkcję znacznika (beacona). Jest to kluczowe dla osiągnięcia następujących funkcji:
   1. Identyfikacja i monitorowanie poziomu, na którym komórki są skoncentrowane w bloku komórkowym. Odsłonięcie ciemnego znacznika wskazuje poziom, na którym spodziewana jest lokalizacja większości pojedynczo rozproszonych komórek w bloku komórkowym (Rysunek 4). Zapobiega to przecięciu (cięciu poza poziom z największą liczbą komórek) lub niedocięciu (niewystarczająco głębokiemu cięciu do poziomu o najwyższym stężeniu komórek próbki) bloku komórkowego i umożliwia wybór przekrojów z poziomu bloku komórkowego odpowiadającego najwyższej koncentracji komórek.
   2. Ciemny znacznik w przekrojach służy również jako punkt odniesienia do przeglądu i dokładnej identyfikacji tych samych komórek w różnych sekcjach seryjnych bloku komórkowego na różnych szkiełkach (Rysunek 4). Jest to kluczowe podczas interpretacji i oceny właściwości koordynacyjnych, takich jak immunoprofil konkretnych komórek, przy zastosowaniu podejścia SCIP w celu śledzenia tych samych komórek w różnych przekrojach (6,7).

Chociaż nasz protokół jest zestandaryzowany i opisany dla próbek cytologicznych szyjki macicy w metodzie płynnej, może on być również stosowany w celu zwiększenia wydajności diagnostycznej wielu innych próbek nieginekologicznych, takich jak płyny z wysięków, biopsje aspiracyjne cienkoigłowe (FNA), wymazy szczoteczkowe, treści torbieli itp. Dodatkowo marker AV ułatwiłby lepsze zastosowanie podejścia SCIP podczas oceny immunohistochemicznej preparatów z bloków komórkowych tych próbek. Medium do zatapiania można zastąpić innymi odczynnikami, wprowadzając odpowiednie modyfikacje w istotnych etapach. HG można zastąpić osoczem (Fibrinogen), które zostanie żelowane przez Thrombin w temperaturze pokojowej (1).