Preparat bloku komórkowego z próbki cytologicznej z przewagą komórek pojedynczo rozproszonych

Wprowadzenie:

To jest film opisujący metodę Shidhama do przygotowania bloku komórkowego z próbki cytologii na bazie płynu (LBC) przy użyciu HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). W porównaniu z innymi podejściami losowymi, poniżej przedstawiono dwie krytyczne cechy tego protokołu do przygotowania bloków komórkowych ze stosunkowo hipokomórkowych próbek z pojedynczo rozproszonymi luźnymi komórkami (1-5).

1. Protokół ten obejmuje kroki mające na celu skoncentrowanie komórek wzdłuż płaszczyzny równoległej do powierzchni cięcia bloku komórek.
2. Zawiera również ciemne włączenie markera AV (Rysunek 1b), które służy dwóm z następujących celów:
   1. Aby zobrazować poziom, na którym komórki są skoncentrowane. Obszar bloku komórkowego z komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania może być teraz uwidoczniony przez histotechnologa, gdy ciemna latarnia morska jest odsłonięta podczas cięcia. Ta zdolność do monitorowania zapobiegłaby przecięciu poziomu z większością komórek, lub nie wcięciu zbyt powierzchownie w poziom o najwyższym stężeniu komórek próbki.
   2. Służy jako punkt odniesienia lokalizatora w sekcji bloku komórki szeregowej na różnych slajdach. Ten punkt odniesienia działa jak latarnia morska, która pomaga zlokalizować określone komórki lub grupy komórek w celu oceny współrzędnego wzorca immunoreaktywności za pomocą podejścia SCIP (6,7).

PROTOKÓŁ (Rysunek 2)

Przygotowanie próbki.

1. Przenieś pozostałą próbkę cytologii szyjki macicy LBC do szklanej rurki o płaskim dnie (średnica 15 mm x 45 mm) (ryc. 2.1 do 2.4).  Umieść szklaną probówkę w większej plastikowej probówce nośnej (28 x 85 mm) i odwiruj.  Wyjąć szklaną dolną rurkę z rurki nośnej i odlewać supernatant.
2. Szklana rurka jest następnie zakręcana (aby zapobiec rozlaniu wody grzewczej w następnym kroku) i umieszczana z powrotem w większej plastikowej rurze nośnej z płaskim dnem
3. Plastikowa rurka nośna zawierająca szklaną rurkę jest następnie zamykana, umieszczana w wirówce (z obrotowymi kubkami i niestałymi kubkami kątowymi, tak aby komórki opadały prostopadle do płaskiego dna szklanej rurki) i wirowana z prędkością 1805 G (3000 obr./min, promień wirnika - 17 cm) przez pięć minut (ryc. 2.5).
4. Probówki są następnie wyjmowane pionowo z wirówki, a mniejsza szklana rurka jest usuwana za pomocą kleszczy z większej plastikowej rurki nośnej bez naruszania osadzonego osadu z komórkami.
5. Szklaną rurkę z próbką odkręca się i wylewa się supernatant, uważając, aby nie naruszyć płaskiej warstwy komórek osadu na dnie (rysunek 2.6).

Włączenie referencyjnej współrzędnej AV-marker i dodanie żelu

1. Jako drogowskaz do szklanej rurki dodaje się ciemny znacznik AV latarni (o wymiarach około 2 mm x 2 mm, o płaskiej powierzchni, fragment ciemnego koloru, nadający się do przekroju materiał) (ryc. 3) jako drogowskaz do szklanej rurki (ryc. 2.7).
2. Skroplić porcję HG, topiąc ją w kuchence mikrofalowej przez 10 sekund przy średniej mocy.
3. Dodać 0,5 ml stopionego HG do probówki, szybko wymieszać z osadem i ponownie go zakryć (Rysunek 2.8) (Szybko przejść do następnego kroku, nie dopuszczając do tego, aby HG zaczął krzepnąć).
4. Dodać około 2,5 ml ciepłej (45°C) wody do plastikowej rurki nośnej (rysunek 2.9).
5. Mniejsza szklana rurka z nakrętką jest umieszczana wewnątrz plastikowej rurki z ciepłą wodą. (Ten krok jest niezbędny, aby zapobiec zestaleniu się HG podczas kolejnych kroków) (Rysunek 2.9).
6. Plastikową rurkę nośną umieszcza się w wirówce (z obrotowymi kubkami i nieustalonymi kubkami kątowymi, tak aby komórki opadały prostopadle do płaskiego dna szklanej probówki) i wiruje z prędkością 1805 G (3000 obr./min, promień wirnika - 17 cm) przez pięć minut. Celem tego etapu wirowania jest wypchnięcie markera AV i zagęszczenie komórek w warstwie bliżej powierzchni cięcia końcowego bloku komórkowego zatopionego w parafinie (rysunek 1d).
7. Probówki są następnie delikatnie i pionowo wyjmowane z wirówki, uważając, aby nie naruszyć osadzonej cienkiej warstwy z komórkami próbki na dnie.
8. Większa plastikowa rurka jest odkręcana, a mniejsza szklana rurka jest usuwana pionowo za pomocą kleszczy bez naruszania warstwy osadu komórek próbki.
9. Małą szklaną rurkę przechowuje się w lodówce w pozycji pionowej przez 15 minut w celu schłodzenia i zestalenia HG (rysunek 2.11).

Usunięcie bloku komórkowego jako przycisku żelu z próbką do końcowego przetwarzania

1. Zestalony krążek HG z warstwą skoncentrowanej próbki / osadu na dnie jest usuwany ze szklanej rurki o płaskim dnie przez wstrzyknięcie 10% formaliny przez igłę o rozmiarze 23 za pomocą strzykawki (ryc. 2.12).
2. Igłę wprowadza się wzdłuż boku rurki na obrzeżach zestalonego krążka HG z próbką (ryc. 2.12).
3. Igła jest obracana wzdłuż boku rurki, podczas gdy formalina jest powoli przepychana przez strzykawkę. Powoduje to oddzielenie przycisku HG wraz z ciemnokolorowym markerem AV sygnalizatora i zagęszczoną w nim próbką od płaskiego dna szklanej rurki (rysunek 2.12).
4. Blok komórek (żelowy guzik z próbkami komórek) jest następnie umieszczany w oznakowanej kasecie i przekazywany do przetwarzania tkanek w celu przygotowania bloków komórkowych zatopionych w parafinie (ryc. 2.13).

Osadzanie i wycinanie próbki

1. Dysk jest zanurzony w parafinie z ciemnym markerem ostrzegawczym skierowanym do dołu jako powierzchnia cięcia (rysunek 1).
2. Blok jest dzielony na sekcje, aż ciemny znacznik AV jako latarnia morska zostanie odsłonięty i wyraźnie widoczny.
3. Z tego poziomu wycina się od trzech do czterech mikronów, które powinny zawierać większość pojedynczo rozproszonych komórek z próbki.
4. Skrawki są zbierane na szkiełku podstawowym w celu dalszego barwienia, barwienia immunohistochemicznego lub innych badań, zgodnie ze wskazaniami. Protokoły tych testów, w tym rodzaj prowadnic używanych do montażu sekcji, mogą się różnić. Ogólnie rzecz biorąc, do barwienia immunologicznego stosuje się szkiełka powlekane, aby zapobiec unoszeniu się i utracie odcinków ze szkiełek podczas etapów barwienia immunologicznego.

Używane skróty (w kolejności alfabetycznej): CISH, chromogeniczne testy hybrydyzacji in-situ; FISH, fluorescencyjne testy hybrydyzacji in-situ; FFPE, utrwalany w formalinie zatopiony w parafinie; FNA, aspiracja cienkoigłowa; HG, HistoGel™ (Thermo Scientific); LBC, cytologia płynna; Reakcja łańcuchowa polimerazy PCR;

Rysunek 1. Struktura bloku komórkowego przygotowana przez protokół Shidhama.

Rysunek 2. Podsumowanie różnych etapów przygotowania bloku komórkowego z próbki LBC według protokołu Shidhama.

Rysunek 3. Przygotowanie markera AV ze skórki banana

Rysunek 4. Porównanie bloków i sekcji komórek z markerem AV i bez niego.

Rysunek 5. Porównanie komórkowości odcinków bloku komórkowego z markerem przedsionkowo-komorowym i bez niego.

Cell blocks are a valuable tool for evaluation of various cytology specimens (1). Most importantly, in addition to the architectural details of the specimen, cell blocks allow for evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, fluorescent/chromogenic in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ PCR. A variety of methods for preparation of cell block are described. However, most of these are suitable for non-gynecologic cytology specimens which contain relatively many cells and with tissue microfragments such as in FNA aspirates and some serous fluids such as effusions (1,3,4,5).

Because cell blocks primarily provide the opportunity for immunocytochemical evaluation, their processing should preferably be similar to that of the formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Ultimately the results obtained after immunocytochemical evaluation of cell block sections are compared to those with the published literature performed predominantly on FFPE tissue sections. Any alterations in the protocol potentially compromise and nullify the validity of the results obtained on cell blocks processed through different fixatives and reagent sequences other than that used for routine FFPE. Some commercial techniques may have the drawback of processing through a protocol of exposure to other fixative-reagent exposure.

Various methods of cell block preparation are available for specimens with a significant quantity of sediment and tissue fragments. Principally, the concentrated sediments are supported by some gel or coagulation principle. The maneuverable button is then embedded in paraffin after processing like the surgical pathology specimens/biopsies.

The gels used include gelatin, agar, fibrinogen/plasma-thrombin, and other commercial gels such as HG. The methods of concentration vary from simple pelleting of the sediment by centrifugation to concentration of cells along various types of membranes. Examples include: Milipore, collodin (Celloidin) bags or scraping the cells from the cytology smears on glass slides (1). We also evaluated a variety of gels by trying different combinations of agar and gelatin. None of the combinations achieved the a firm enough consistency to obtain an easily maneuverable disc of solidified gel with embedded cells from the specimen in one piece. HG showed appropriate consistency and in our experience the immunostaining results on HG cell block sections have been excellent.

Liquid based cytology (LBC) specimens for cervicovaginal cytology are generally less cellular than non-gynecologic specimens as mentioned above. In addition, the gynecologic LBC specimens predominantly contain individual scattered exfoliated superficial cells from cervicovaginal mucosa. Due to this, appropriate cellularity within the cell block sections may not be achieved without a special approach. As these singly scattered cellular components in the the block cannot be seen by the histotechnologist during section cutting, the level at which the cells start appearing in the sections cannot be appreciated and may be missed, either by cutting past the level with most cells or not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells (Figure 4). Shidham’s protocol addresses both of these issues using HG as embedding medium and conventional lab equipments (2) (Figure 2).

This protocol involves following two major features (Figure 1):

1. Concentration and alignment of singly scattered cells in a narrow plane adjacent and parallel to the cutting surface of the cell block (Figure 5).
2. Inclusion of a beacon-like dark AV-marker as a signpost. This is critical for achieving following features:
   1. Identifying and monitoring the level at which the cells are concentrated in the cell block. The exposure of the dark colored signpost highlights the level at which most of the singly scattered cells in the cell block are expected to be located (Figure 4). This prevents the overcutting (cutting past the level with most cells) or undercutting (not cutting deep enough into the level with highest concentration of sample cells) in to the cell block and allow selection of the sections from the level in the cell block corresponding with highest concentration of cells.
   2. The dark colored signpost in the sections also serves as a reference point to survey and identify exactly the same cells in different serial sections of the cell block on different slides (Figure 4). This is critical while interpreting and evaluating the coordinate properties such immunoprofile of particular cells by the SCIP approach to follow the same cells in different sections (6,7).

Although our protocol is standardized and reported for liquid based cervical cytology specimens, it can also be used to enhance diagnostic yield of many other non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc. In addition the AV marker would facilitate improved application of SCIP approach during immunohistochemical evaluation of cell block sections of these specimens. The embedding medium may be replaced by other reagents with appropriate modifications at relevant steps. HG may be replaced by plasma (Fibrinogen) to be gelled by Thrombin at room temperature (1).