Obrazowanie restenozy wewnątrzstentowej: niedrogi, niezawodny i szybki model przedkliniczny

Podsumowanie

W niniejszym materiale wideo przedstawiono sposób wykorzystania niedrogiego i niezawodnego modelu przedklinicznego do badania procesów patobiologicznych i patofizjologicznych rozwoju restenozy wewnątrzstentowej. Zaprezentowano również podłużny monitoring in vivo z wykorzystaniem OCT (optycznej koherentnej tomografii) oraz analizę obrazów OCT.

Streszczenie

Przedkliniczne modele restenozy są niezbędne do wyjaśnienia procesów patofizjologicznych prowadzących do restenozy wewnątrzstentowej oraz do optymalizacji istniejących i przyszłych stentów uwalniających lek.

Dostępna jest szeroka gama przeciwciał oraz szczepów transgenicznych i knockout w przypadku szczurów. W związku z tym model restenozy wewnątrzstentowej u szczura byłby dogodny do prowadzenia badań patobiologicznych i patofizjologicznych.

W tym filmie przedstawiamy pełną procedurę oraz potencjalne problemy związane z modelem stenta u szczura, który jest odpowiedni do wysokoprzepustowych badań nad stentami. Omówimy chirurgiczną procedurę implantacji stenta oraz ocenę restenozy wewnątrzstentowej z wykorzystaniem najbardziej precyzyjnej techniki, jaką jest OCT (tomografia optyczna koherentna). Technika ta zapewnia wysoką dokładność w ocenie powierzchni przekroju poprzecznego (CSA) blaszek miażdżycowych i dobrze koreluje z badaniami histologicznymi, które wymagają specjalistycznych i czasochłonnych technik zatapiania i krojenia tkanek. Obrazowanie OCT pozwala ponadto na monitorowanie podłużne rozwoju restenozy wewnątrzstentowej u tego samego zwierzęcia, w przeciwieństwie do jednorazowych pomiarów w histologii.

Protokół

Implementacja stentu aortalnego

1. Samce szczurów Sprague-Dawley o masie 550-600 g są nabywane od firmy Harlan (Indianapolis, IN, USA). Szczury utrzymuje się w warunkach konwencjonalnych, podając standardową karmę dla szczurów oraz wodę ad libitum.
2. Szczura znieczula się izofluranem (2%) i ketaminą (25 mg/kg). Pod kontrolą mikroskopową wykonuje się górną medianową mini-laparotomię w celu odsłonięcia aorty podnerkowej.
3. Aortę brzuszną preparuje się z otaczających tkanek, od poziomu tętnic nerkowych w dół aż do rozwidlenia. UWAGA: Nie ma potrzeby preparowania aorty od żyły głównej dolnej.
4. Używa się mikrozacisków do zatrzymania przepływu krwi w aorcie. Najpierw zakłada się zacisk proksymalny, a następnie dystalny.
5. Aortę otwiera się za pomocą małego nacięcia poprzecznego i przepłukuje heparyną (200 units).
6. Śródbłonek aorty jest usuwany poprzez wprowadzenie cewnika do embolektomii tętniczej Fogarty o rozmiarze 2-french (Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA).
7. Należy użyć dowolnego stentu dla ludzi o długości od 8mm do 12mm i średnicy 2.5mm-3mm. UWAGA: Średnica stentu nie powinna przekraczać średnicy naczynia o więcej niż 10%, aby uniknąć stenozy przed i za stentem. UWAGA: Nie należy zmieniać długości stentu w obrębie tego samego badania.
8. Stent implantuje się, stosując odpowiednie ciśnienie balonu w celu uzyskania pożądanej średnicy.
9. Małe nacięcie aorty zamyka się szwami Prolene 9-0 (Ethicon, Norderstedt, Germany).
10. Nacięcie brzuszne zamyka się warstwowo szwami ciągłymi Vicryl 4-0 (Ethicon, Norderstedt, Germany).
    Szewy skórne powinny zostać usunięte w ciągu 7-14 dni, nawet w przypadku zastosowania Vicryl.
11. Zwierzęta otrzymały Carprofen (6mg/KG) śródoperacyjnie oraz Metamizol przez kolejne 7 dni w wodzie do picia.

Obrazowanie metodą optycznej koherentnej tomografii (OCT)

Obrazy OCT są pozyskiwane za pomocą systemu obrazowania M2 OCT (LightLab Imaging, Inc., Westford, MA, USA). ImageWire to sonda obrazująca służąca do dostarczania światła do tkanki i zbierania sygnałów. ImageWire składa się z rdzenia światłowodowego o średnicy 0.006" (0.15 mm), umieszczonego w osłonie o maksymalnej średnicy zewnętrznej 0.019" (0.48 mm).

1. Zanurz szczura w narkozie z użyciem izofluranu (2%) i ketaminy (25 mg/kg). Pod kontrolą mikroskopu przeprowadź ponowną laparotomię pośrodkową, aby odsłonić aortę podnerkową.
2. Zaklemuj proksymalny odcinek aorty oraz obie tętnice biodrowe.
3. Wykonaj poprzeczną arteriotomię na dystalnym końcu aorty, przepłucz naczynie 1ml PBS za pomocą cewnika 28G, a następnie wprowadź cewnik OCT i przesuń go w głąb aorty.
4. Obrazowanie OCT z motoryzowanym wycofywaniem wykonuje się przy prędkości wycofywania 1,0 mm na sekundę.
5. Nabywaj obrazy z częstotliwością 15 klatek na sekundę; obrazy są wyświetlane z wykorzystaniem tablicy mapowania kolorów i archiwizowane cyfrowo.
6. Zamknij arteriotomię.
7. Zamknij powłoki brzuszne i nacięcia za pomocą szwów ciągłych 4-0 Vicryl (Ethicon, Norderstedt, Niemcy).
   Szwy skórne należy usunąć w ciągu 7-14 dni, nawet w przypadku zastosowania Vicryl.
8. Maksymalne tworzenie się neointimy rozwinie się w ciągu 6 tygodni po implantacji stentu.

Analiza obrazów OCT

Pomiary OCT są wykonywane przy użyciu autorskiego oprogramowania do obrazowania LightLab OCT z interfejsem dostosowanym do szczura.

1. Przeprowadź kalibrację systemu względem odbicia drutu obrazowania OCT, co stanowi standardową technikę kalibracji dla tego systemu.
2. Ręcznie obrysuj pola przekroju poprzecznego (CSA) światła naczynia oraz stentu w odstępach co 1,0 mm.
3. Oblicz pole przekroju poprzecznego blaszki miażdżycowej, odejmując CSA światła od CSA stentu. Oblicz procentowy obszar blaszki jako CSA blaszki podzielone przez CSA stentu (%). Oblicz średni procentowy obszar blaszki.

Walidacja techniki OCT

Wyniki OCT dobrze korelują z badaniem histopatologicznym (Rysunek 1). Powierzchnie przekroju poprzecznego (CSA) blaszek miażdżycowych w badaniu histologicznym oblicza się zgodnie z powyższym opisem. Badanie histologiczne wykazuje hiperplazję intimy z wysoką gęstością komórek wrzecionowatych i niewielką liczbą mononuklearnych komórek zapalnych. Po 6 tygodniach stenty są całkowicie pokryte tkanką ziarninową neointimy, a CSA blaszki wynosi 1.3±0.4 mm² w stencie o rozmiarze 2.5mm.

Rysunek 1: Obrazy OCT (A) i histologiczne (B; powiększenie 16x) stentu 6 tygodni po implantacji. Wyniki CSA blaszki uzyskane z obrazów OCT dobrze korelują z badaniem histopatologicznym. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

Dyskusja

Chociaż modele tętnicy biodrowej królika i tętnicy wieńcowej świni są najczęściej stosowane do implantacji stentów ¹, wymagają one zastosowania kombinacji sprzętu radiologicznego i chirurgicznego, pojemność pomieszczeń dla zwierząt jest ograniczona, a koszty zakupu są wysokie. Ograniczeniami modelu stentu u szczura są konieczność stosowania stentów zaprojektowanych specjalnie dla szczurów, stosunek metalu do tętnicy skutkujący większymi uszkodzeniami naczyniowymi² oraz sztucznie wysoka częstość występowania zakrzepicy³.

Model stentowania u szczura jest prostym, niedrogim, szybkim i dokładnym modelem przedklinicznym ⁴. Po wstępnej publikacji Lowe i współpracowników dotyczącej bezpośredniego stentowania aorty szczura ⁵, wykazano szczegółowo wykonalność i przydatność tego modelu do oceny patofizjologii restenozy wewnątrzstentowej ^5,6. Średnica aorty szczura jest wystarczająca, aby umożliwić rozszerzenie dostępnych komercyjnie stentów bez naruszenia fizjologicznej architektury naczynia. Wykazano, że mechanizmy patofizjologiczne, takie jak tworzenie zakrzepów, zapalenie i proliferacja SMC, rozwijają się w tych modelach szczurzych analogicznie jak u królików i świń. W związku z tym modele te stanowią dobre odwzorowanie rzeczywistego procesu restenozy.

Technologia obrazowania wysokiej rozdzielczości OCT jest użyteczna w ocenie hiperplazjitmy. Głębokość penetracji wynosi zaledwie 1,5-2 mm, jednak jej rozdzielczość jest o rząd wielkości większa niż w przypadku wewnątrznaczyniowego ultrasonografu (IVUS) ^7,8. Liczne badania porównujące OCT z IVUS prowadzą do wniosku, że OCT jest obecnie preferowaną techniką oceny hiperplazji neointimy po implantacji stentu ^8-10. Zwłaszcza w przypadku małych zwierząt o niewielkich średnicach naczyń, wysoka rozdzielczość OCT czyni tę metodę najlepszą modalnością obrazowania do oceny restenozy.

Podsumowując, niniejszy film pokazuje, że (1) stenting aorty szczura jest łatwo wykonalny, (2) stenting aorty brzusznej szczura nadaje się do testowania stentów produkowanych komercyjnie oraz (3) obrazowanie OCT jest dokładną i elegancką techniką do długofalowego monitorowania restenozy wewnątrzstentowej.