Artykuł metodologiczny

Generowanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40

15K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1373

⸱

16 października 2009

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Tumor and Transplantation Immunology and Stem Cell Transplantation Program, University Hospital of Cologne, Department I of Internal Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

W tym filmie przedstawiamy generowanie oraz ekspansję ex vivo ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 (CD40-B) z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) poprzez stymulację ligandem CD40 oraz interleukiną-4.

Streszczenie

Komórki B aktywowane przez CD40 (komórki CD40-B) zostały zidentyfikowane jako alternatywne źródło immunostymulujących komórek prezentujących antygen (APC) w immunoterapii nowotworów 1-3. W porównaniu do komórek dendrytycznych (DC), które są najlepiej poznanymi APC, komórki CD40-B posiadają kilka odrębnych właściwości biologicznych i technicznych. Podobnie jak DC, komórki B wykazują zwiększoną ekspresję MHC i cząsteczek kostymulujących (Rys. 1b), posiadają silną zdolność migracyjną i efektywnie prezentują antygeny komórkom T po stymulacji interleukiny-4 oraz ligandem CD40 (CD40L). Jednak w przeciwieństwie do niedojrzałych lub dojrzałych DC, komórki CD40-B wykazują pełną triadę homingu do węzłów chłonnych, składającą się z CD62L, CCR7/CXCR4 oraz antygenu funkcji leukocytarnej-1 (LFA1, CD11a/CD18), niezbędną do migracji do wtórnych narządów limfatycznych (Rys. 1a) 3. Komórki CD40-B mogą być bez trudności generowane z bardzo małych ilości krwi obwodowej, które mogą być następnie namnażane in vitro do bardzo dużych ilości wysoko oczyszczonych komórek CD40-B (>109 komórek na pacjenta), zarówno od zdrowych dawców, jak i od pacjentów onkologicznych (Rys. 1c,d) 1,4.

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób otrzymywania w pełni aktywowanych komórek CD40-B z ludzkich PBMC. Kluczowymi cząsteczkami dla hodowli komórkowej są ligand CD40, interleukina-4 (IL-4) oraz cyklosporyna A (CsA), które są uzupełniane w 3-4 dniowym cyklu hodowli. Do celów laboratoryjnych stymulacja CD40 jest zapewniana przez komórki NIH/3T3 wykazujące ekspresję rekombinowanego ludzkiego ligandu CD40 (tCD40L NIH/3T3) 5. Aby uniknąć kontaminacji komórkami nietransfekowanymi, należy regularnie sprawdzać ekspresję ludzkiego ligandu CD40 na transfektantach (Ryc. 2).

Po 14 dniach hodowle komórek B CD40 składają się w ponad 95% z czystych limfocytów B, a ekspansja komórek B CD40 przez okres ponad 65 dni jest często możliwa bez utraty ich funkcji. 1, 4Komórki B wykazujące ekspresję CD40 efektywnie pobierają, przetwarzają i prezentują antygeny komórkom T 6Nie tylko one torują drogę naϊve, ale także zwiększyć liczbę komórek T pamięci 7,8Aktywowane CD40 limfocyty B mogą być wykorzystywane do badania aktywacji, różnicowania i funkcji limfocytów B. Ponadto stanowią one obiecujące narzędzie w przypadku szczepień terapeutycznych lub profilaktycznych przeciwko nowotworom. 9.

Protokół

Protokół generowania ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 z PBMC jest podzielony na dwie części: część A przedstawia przygotowanie komórek NIH/3T3 wykazujących ekspresję liganda CD40, które posłużą jako przytwierdzone do płytki komórki karmidła. Część B opisuje właściwą hodowlę CD40-B.

A. Przygotowanie komórek karmionek (tCD40L NIH/3T3)

tCD40L NIH/3T3 to adherentna linia komórkowa fibroblastów mysich, która nigdy nie powinna osiągnąć pełnej konfluencji. W związku z tym komórki należy pasażować dwa razy w tygodniu. Nie zaleca się hodowli trwającej powyżej 6 tygodni.

  1. Usunąć stare podłoże z kultury pierwotnej za pomocą sterylnej pipety i przemyć komórki 10 mL 1x PBS. Po przemyciu odessać PBS.
  2. Dodać 4 mL Trypsyny/EDTA do kolby o powierzchni 75 cm2 na 5-10 minut w temperaturze 37°C. Delikatnie opukać kolbę, aby odczepić komórki.
  3. Dodać 10 mL podłoża typu dzikiego i delikatnie wymieszać.
  4. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 50 mL sterylną pipetą i odwirować komórki przy 225 x g przez 5 min.
  5. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 10 mL podłoża typu dzikiego. Policzyć liczbę komórek w aliquocie zawiesiny komórkowej i przygotować trzy probówki 50 mL z odpowiednią liczbą komórek:
    1. 1,5 x 106 komórek do subkultury
    2. 0,2 x 106 komórek/studzinkę do naświetlania wykorzystywanego w kulturze komórek CD40-B
    3. pozostałą część do zamrożenia (jeśli jest wymagane).
  6. Odwirować komórki przy 225 x g przez 5 min.
  7. Usunąć nadsącz.
    1. Do subkultury: resuspendować 1,5 x 106 komórek w 10 mL podłoża typu dzikiego w kolbie do hodowli komórkowej o powierzchni 75 cm2 (gęstość komórek 1,5 x 105 komórek/mL), dodać G-418 [0,7 mg/mL] i inkubować komórki w 37°C przy 5 % CO2. Przesiewać komórki dwa razy w tygodniu.
    2. Do kultury komórek CD40-B: wymagane jest 1,2 x 106 komórek na jedną płytkę 6-studzienkową. Resuspendować komórki w podłożu typu dzikiego w gęstości 0,1 x 106 komórek/mL i naświetlić dawką 78 Gy. Przenieść po 2 mL zawiesiny komórkowej do każdej studzienki i inkubować w 37°C przy 5 % CO2. Przygotowanych płytek użyć do stymulacji komórek B, gdy komórki tCD40L NIH/3T3 będą przylegać (minimum 4 godziny: sprawdzić adhezję pod mikroskopem; nie czekać więcej niż 24 h przed rozpoczęciem stymulacji komórek B). (Kontynuować z punktem B.)

B. Hodowla limfocytów B z CD40

I. Przygotowanie PBMC do stymulacji CD40 (dzień 0):

Uwaga: przed kontynuacją należy upewnić się, że komórki karmione (feeder cells) przylegają do podłoża. Zawsze należy dodawać świeże roztwory interleukiny-4 oraz cyklosporyny A do pożywki wzrostowej bezpośrednio przed użyciem.

  1. Przygotować PBMC, świeże lub odpowiednio rozmrożone. Resuspendować PBMC dwukrotnie w 50 mL 1x PBS w celu ich przemycia i odwirować pierwszy raz przy 265 x g przez 7 min, a drugi raz przy 190 x g przez 7 min, aby usunąć pozostałe komórki. Odpić nadsącz i resuspendować komórki w 20 mL PBS. Określić liczbę komórek w alikwocie zawiesiny komórkowej.
  2. Odwirować wymaganą liczbę komórek przy 225 x g przez 5 min. Dla płytki 6-dołkowej wymagane jest 4 x 106 komórek / dołek, zatem 24 x 106 komórek na płytkę.
  3. Usunąć nadsącz i resuspendować PBMC w stężeniu 1 x 106 komórek/mL w pożywce hodowlanej CD40-B, świeżo uzupełnionej o 50 U/mL interleukiny-4 jako czynnika wzrostu oraz 0,63 μg/mL cyklosporyny A, aby zapobiec namnażaniu się limfocytów T (Podane stężenia odnoszą się do jednego mL pożywki hodowlanej!).
  4. Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, w której wcześniej inkubowano komórki tCD40L NIH/3T3.
  5. Przemyć przylegające komórki tCD40L NIH/3T3 najpierw 2 mL PBS na dołek, a w drugim kroku 2 mL pożywki piorzącej CD40-B.
  6. Ostrożnie dodać 4 mL zawiesiny PBMC (1 x 106 komórek/mL) do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
  7. Inkubować komórki w temperaturze 37°C przy 5 % CO2.
  8. W 7. dniu przeprowadzić pasaż komórek (Kontynuować zgodnie z punktem 3.2.).

II. Rekultywacja komórek CD40-B (dzień 7, a następnie co 3-4 dni):

  1. Zebrać skupiska komórek CD40-B z płytki 6-dołkowej, resuspendując je za pomocą pipety 10 mL, a następnie przenieść je do probówki 50 mL.
  2. Wirować z prędkością 225 x g przez 7 minut i całkowicie zastąpić nadsącz medium do mycia CD40-B. Podczas liczenia komórek w alikwocie, wirować komórki z prędkością 225 x g przez 5 minut. Resuspender komórki CD40-B w medium hodowlanym CD40-B do stężenia 1 x 106 komórek/mL.
  3. Do medium dodać świeże roztwory interleukiny-4 w stężeniu 50 U/mL oraz cyklosporyny A w stężeniu 0,63 μg/mL.
  4. Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, w której wcześniej inkubowano komórki tCD40L NIH/3T3.
  5. Przemyć komórki adherentne, stosując najpierw 2 mL PBS na dołek, a w drugim kroku 2 mL medium do mycia CD40-B.
  6. Ostrożnie dodać 4 mL (1 x 106 komórek/mL) zawiesiny CD40-B do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
  7. Inkubować płytki w temperaturze 37°C przy 5 % CO2.
  8. Powtarzać pasażowanie komórek co 3-4 dni, aby po łącznie 14 dniach uzyskać wysoko oczyszczone ludzkie komórki B aktywowane przez CD40.

C. Rozwiązywanie problemów – co zrobić, jeśli komórki CD40-B nie rosną?

  1. Czy sprawdzono ekspresję liganda CD40 w komórkach karmicielkach?
  2. Czy komórki karmicielki unieruchomione na płytce, użyte do stymulacji, nie są starsze niż 24h?
  3. Czy możliwe jest zanieczyszczenie mycoplasmas?
  4. Czy roztwór interleukiny-4 użyty do suplementacji był świeżo rozmrożony i posiadał odpowiednią aktywność biologiczną?
  5. Czy cyklosporyna A została dodana w odpowiednim stężeniu?

Analiza cytometrii przepływowej: markery CD, intensywność fluorescencji; wykresy przedstawiają badanie aktywacji komórek odpornościowych.
Rycina 1. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.

Schemat cytometrii przepływowej FACS: wykres SSC vs FSC, histogram ekspresji CD154, intensywność fluorescencji.
Rycina 2. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A. Przygotowanie pożywek:
1. Pożywka dla komórek feeder typu dzikiego
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamina (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycyna (15 μg/mL)
2. Pożywka do selekcji komórek feeder
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamina (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycyna (15 μg/mL)
G-418 (0,7 mg/mL)
3. Pożywka do przemywania CD40-B
IMDM
L-Glutamina (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycyna (15 μg/mL)
4. Pożywka hodowlana CD40-B
IMDM
L-Glutamina (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycyna (15 μg/mL)
rh Transferryna (50 μg/mL)
rh Insulina (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Odczynniki różnorodne:
DMEM / Ham’s F12PAA LaboratoriesNr kat.: E15-813
IMDMInvitrogenREF 21980-032
PBS Dulbecco’s (10x)PAA LaboratoriesNr kat. H15-011
AB-Human SerumInvitrogenNr kat. 34005100
holo-Transferryna ludzkaSigma-AldrichNr kat. T0665
Insulina ludzkaSigma-AldrichNr kat. I2643
Gencin®Delta SelectNr art. 7395800
Rekombinowana ludzka interleukina-4ImmunotoolsNr kat. 11130045
Cyklosporyna ANovartis AGNr kat. NDC 0078-0109-01
FBSLonza Inc.Nr kat. DE14-802C
Bufor HEPESPAA LaboratoriesNr kat. S11-001
Siarczan G-418PAA LaboratoriesNr kat. P02-012
Trypsyna/EDTA (10x)InvitrogenREF 15400-054
C. Materiały różnorodne:
Sterylne końcówki do pipetSarstedt Ltd
Płytka 6-dołkowaNalge Nunc internationalNr kat. 140675
Probówka stożkowa 50 mLBD BiosciencesNr kat. 352070
Kolba do hodowli tkankowychSarstedt LtdNr kat. 83.1813.002

Bibliografia

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mononuklearne kom rki krwi obwodowejligand CD40interleukina 4cyklosporyna Akom rki NIH 3T3przygotowanie kom rek dokarmiaj cychekspansja hodowli kom rkowejprezentacja antygenuhoming do w z w ch onnych

Powiązane artykuły