W tym filmie przedstawiamy generowanie oraz ekspansję ex vivo ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 (CD40-B) z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) poprzez stymulację ligandem CD40 oraz interleukiną-4.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generowanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki B aktywowane przez CD40 (komórki CD40-B) zostały zidentyfikowane jako alternatywne źródło immunostymulujących komórek prezentujących antygen (APC) w immunoterapii nowotworów 1-3. W porównaniu do komórek dendrytycznych (DC), które są najlepiej poznanymi APC, komórki CD40-B posiadają kilka odrębnych właściwości biologicznych i technicznych. Podobnie jak DC, komórki B wykazują zwiększoną ekspresję MHC i cząsteczek kostymulujących (Rys. 1b), posiadają silną zdolność migracyjną i efektywnie prezentują antygeny komórkom T po stymulacji interleukiny-4 oraz ligandem CD40 (CD40L). Jednak w przeciwieństwie do niedojrzałych lub dojrzałych DC, komórki CD40-B wykazują pełną triadę homingu do węzłów chłonnych, składającą się z CD62L, CCR7/CXCR4 oraz antygenu funkcji leukocytarnej-1 (LFA1, CD11a/CD18), niezbędną do migracji do wtórnych narządów limfatycznych (Rys. 1a) 3. Komórki CD40-B mogą być bez trudności generowane z bardzo małych ilości krwi obwodowej, które mogą być następnie namnażane in vitro do bardzo dużych ilości wysoko oczyszczonych komórek CD40-B (>109 komórek na pacjenta), zarówno od zdrowych dawców, jak i od pacjentów onkologicznych (Rys. 1c,d) 1,4.
W niniejszym protokole demonstrujemy sposób otrzymywania w pełni aktywowanych komórek CD40-B z ludzkich PBMC. Kluczowymi cząsteczkami dla hodowli komórkowej są ligand CD40, interleukina-4 (IL-4) oraz cyklosporyna A (CsA), które są uzupełniane w 3-4 dniowym cyklu hodowli. Do celów laboratoryjnych stymulacja CD40 jest zapewniana przez komórki NIH/3T3 wykazujące ekspresję rekombinowanego ludzkiego ligandu CD40 (tCD40L NIH/3T3) 5. Aby uniknąć kontaminacji komórkami nietransfekowanymi, należy regularnie sprawdzać ekspresję ludzkiego ligandu CD40 na transfektantach (Ryc. 2).
Po 14 dniach hodowle komórek B CD40 składają się w ponad 95% z czystych limfocytów B, a ekspansja komórek B CD40 przez okres ponad 65 dni jest często możliwa bez utraty ich funkcji. 1, 4Komórki B wykazujące ekspresję CD40 efektywnie pobierają, przetwarzają i prezentują antygeny komórkom T 6Nie tylko one torują drogę naϊve, ale także zwiększyć liczbę komórek T pamięci 7,8Aktywowane CD40 limfocyty B mogą być wykorzystywane do badania aktywacji, różnicowania i funkcji limfocytów B. Ponadto stanowią one obiecujące narzędzie w przypadku szczepień terapeutycznych lub profilaktycznych przeciwko nowotworom. 9.
Protokół
Protokół generowania ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 z PBMC jest podzielony na dwie części: część A przedstawia przygotowanie komórek NIH/3T3 wykazujących ekspresję liganda CD40, które posłużą jako przytwierdzone do płytki komórki karmidła. Część B opisuje właściwą hodowlę CD40-B.
A. Przygotowanie komórek karmionek (tCD40L NIH/3T3)
tCD40L NIH/3T3 to adherentna linia komórkowa fibroblastów mysich, która nigdy nie powinna osiągnąć pełnej konfluencji. W związku z tym komórki należy pasażować dwa razy w tygodniu. Nie zaleca się hodowli trwającej powyżej 6 tygodni.
- Usunąć stare podłoże z kul....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| A. Przygotowanie pożywek: | |||
| 1. Pożywka dla komórek feeder typu dzikiego | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamina (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycyna (15 μg/mL) | |||
| 2. Pożywka do selekcji komórek feeder | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamina (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycyna (15 μg/mL) | |||
| G-418 (0,7 mg/mL) | |||
| 3. Pożywka do przemywania CD40-B | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamina (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycyna (15 μg/mL) | |||
| 4. Pożywka hodowlana CD40-B | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamina (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycyna (15 μg/mL) | |||
| rh Transferryna (50 μg/mL) | |||
| rh Insulina (5 μg/mL) | |||
| AB-Humanserum (10%) | |||
| B. Odczynniki różnorodne: | |||
| DMEM / Ham’s F12 | PAA Laboratories | Nr kat.: E15-813 | |
| IMDM | Invitrogen | REF 21980-032 | |
| PBS Dulbecco’s (10x) | PAA Laboratories | Nr kat. H15-011 | |
| AB-Human Serum | Invitrogen | Nr kat. 34005100 | |
| holo-Transferryna ludzka | Sigma-Aldrich | Nr kat. T0665 | |
| Insulina ludzka | Sigma-Aldrich | Nr kat. I2643 | |
| Gencin® | Delta Select | Nr art. 7395800 | |
| Rekombinowana ludzka interleukina-4 | Immunotools | Nr kat. 11130045 | |
| Cyklosporyna A | Novartis AG | Nr kat. NDC 0078-0109-01 | |
| FBS | Lonza Inc. | Nr kat. DE14-802C | |
| Bufor HEPES | PAA Laboratories | Nr kat. S11-001 | |
| Siarczan G-418 | PAA Laboratories | Nr kat. P02-012 | |
| Trypsyna/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Materiały różnorodne: | |||
| Sterylne końcówki do pipet | Sarstedt Ltd | ||
| Płytka 6-dołkowa | Nalge Nunc international | Nr kat. 140675 | |
| Probówka stożkowa 50 mL | BD Biosciences | Nr kat. 352070 | |
| Kolba do hodowli tkankowych | Sarstedt Ltd | Nr kat. 83.1813.002 |
Bibliografia
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
