$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Protokół generowania ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 z PBMC jest podzielony na dwie części: część A przedstawia przygotowanie komórek NIH/3T3 wykazujących ekspresję liganda CD40, które posłużą jako przytwierdzone do płytki komórki karmidła. Część B opisuje właściwą hodowlę CD40-B.
A. Przygotowanie komórek karmionek (tCD40L NIH/3T3)
tCD40L NIH/3T3 to adherentna linia komórkowa fibroblastów mysich, która nigdy nie powinna osiągnąć pełnej konfluencji. W związku z tym komórki należy pasażować dwa razy w tygodniu. Nie zaleca się hodowli trwającej powyżej 6 tygodni.
- Usunąć stare podłoże z kultury pierwotnej za pomocą sterylnej pipety i przemyć komórki 10 mL 1x PBS. Po przemyciu odessać PBS.
- Dodać 4 mL Trypsyny/EDTA do kolby o powierzchni 75 cm2 na 5-10 minut w temperaturze 37°C. Delikatnie opukać kolbę, aby odczepić komórki.
- Dodać 10 mL podłoża typu dzikiego i delikatnie wymieszać.
- Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 50 mL sterylną pipetą i odwirować komórki przy 225 x g przez 5 min.
- Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 10 mL podłoża typu dzikiego. Policzyć liczbę komórek w aliquocie zawiesiny komórkowej i przygotować trzy probówki 50 mL z odpowiednią liczbą komórek:
- 1,5 x 106 komórek do subkultury
- 0,2 x 106 komórek/studzinkę do naświetlania wykorzystywanego w kulturze komórek CD40-B
- pozostałą część do zamrożenia (jeśli jest wymagane).
- Odwirować komórki przy 225 x g przez 5 min.
- Usunąć nadsącz.
- Do subkultury: resuspendować 1,5 x 106 komórek w 10 mL podłoża typu dzikiego w kolbie do hodowli komórkowej o powierzchni 75 cm2 (gęstość komórek 1,5 x 105 komórek/mL), dodać G-418 [0,7 mg/mL] i inkubować komórki w 37°C przy 5 % CO2. Przesiewać komórki dwa razy w tygodniu.
- Do kultury komórek CD40-B: wymagane jest 1,2 x 106 komórek na jedną płytkę 6-studzienkową. Resuspendować komórki w podłożu typu dzikiego w gęstości 0,1 x 106 komórek/mL i naświetlić dawką 78 Gy. Przenieść po 2 mL zawiesiny komórkowej do każdej studzienki i inkubować w 37°C przy 5 % CO2. Przygotowanych płytek użyć do stymulacji komórek B, gdy komórki tCD40L NIH/3T3 będą przylegać (minimum 4 godziny: sprawdzić adhezję pod mikroskopem; nie czekać więcej niż 24 h przed rozpoczęciem stymulacji komórek B). (Kontynuować z punktem B.)
B. Hodowla limfocytów B z CD40
I. Przygotowanie PBMC do stymulacji CD40 (dzień 0):
Uwaga: przed kontynuacją należy upewnić się, że komórki karmione (feeder cells) przylegają do podłoża. Zawsze należy dodawać świeże roztwory interleukiny-4 oraz cyklosporyny A do pożywki wzrostowej bezpośrednio przed użyciem.
- Przygotować PBMC, świeże lub odpowiednio rozmrożone. Resuspendować PBMC dwukrotnie w 50 mL 1x PBS w celu ich przemycia i odwirować pierwszy raz przy 265 x g przez 7 min, a drugi raz przy 190 x g przez 7 min, aby usunąć pozostałe komórki. Odpić nadsącz i resuspendować komórki w 20 mL PBS. Określić liczbę komórek w alikwocie zawiesiny komórkowej.
- Odwirować wymaganą liczbę komórek przy 225 x g przez 5 min. Dla płytki 6-dołkowej wymagane jest 4 x 106 komórek / dołek, zatem 24 x 106 komórek na płytkę.
- Usunąć nadsącz i resuspendować PBMC w stężeniu 1 x 106 komórek/mL w pożywce hodowlanej CD40-B, świeżo uzupełnionej o 50 U/mL interleukiny-4 jako czynnika wzrostu oraz 0,63 μg/mL cyklosporyny A, aby zapobiec namnażaniu się limfocytów T (Podane stężenia odnoszą się do jednego mL pożywki hodowlanej!).
- Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, w której wcześniej inkubowano komórki tCD40L NIH/3T3.
- Przemyć przylegające komórki tCD40L NIH/3T3 najpierw 2 mL PBS na dołek, a w drugim kroku 2 mL pożywki piorzącej CD40-B.
- Ostrożnie dodać 4 mL zawiesiny PBMC (1 x 106 komórek/mL) do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
- Inkubować komórki w temperaturze 37°C przy 5 % CO2.
- W 7. dniu przeprowadzić pasaż komórek (Kontynuować zgodnie z punktem 3.2.).
II. Rekultywacja komórek CD40-B (dzień 7, a następnie co 3-4 dni):
- Zebrać skupiska komórek CD40-B z płytki 6-dołkowej, resuspendując je za pomocą pipety 10 mL, a następnie przenieść je do probówki 50 mL.
- Wirować z prędkością 225 x g przez 7 minut i całkowicie zastąpić nadsącz medium do mycia CD40-B. Podczas liczenia komórek w alikwocie, wirować komórki z prędkością 225 x g przez 5 minut. Resuspender komórki CD40-B w medium hodowlanym CD40-B do stężenia 1 x 106 komórek/mL.
- Do medium dodać świeże roztwory interleukiny-4 w stężeniu 50 U/mL oraz cyklosporyny A w stężeniu 0,63 μg/mL.
- Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, w której wcześniej inkubowano komórki tCD40L NIH/3T3.
- Przemyć komórki adherentne, stosując najpierw 2 mL PBS na dołek, a w drugim kroku 2 mL medium do mycia CD40-B.
- Ostrożnie dodać 4 mL (1 x 106 komórek/mL) zawiesiny CD40-B do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
- Inkubować płytki w temperaturze 37°C przy 5 % CO2.
- Powtarzać pasażowanie komórek co 3-4 dni, aby po łącznie 14 dniach uzyskać wysoko oczyszczone ludzkie komórki B aktywowane przez CD40.
C. Rozwiązywanie problemów – co zrobić, jeśli komórki CD40-B nie rosną?
- Czy sprawdzono ekspresję liganda CD40 w komórkach karmicielkach?
- Czy komórki karmicielki unieruchomione na płytce, użyte do stymulacji, nie są starsze niż 24h?
- Czy możliwe jest zanieczyszczenie mycoplasmas?
- Czy roztwór interleukiny-4 użyty do suplementacji był świeżo rozmrożony i posiadał odpowiednią aktywność biologiczną?
- Czy cyklosporyna A została dodana w odpowiednim stężeniu?
Rycina 1. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.
Rycina 2. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.
