Wykorzystanie kraba podkowiastego, Limulus Polyphemus, w badaniach nad wzrokiem

Podsumowanie

W tym filmie wykonujemy zapis elektroretinogramu, zapis z nerwu wzrokowego oraz zapis wewnątrzsiatkówkowy u amerykańskiego kraba podkowiasty, Limulus Polyphemus. Te paradygmaty elektrofizjologiczne mogą być wykorzystywane do badania neuronalnych podstaw widzenia w laboratoriach badawczych lub dydaktycznych.

Streszczenie

Amerykański krab podkucie, Limulus Polyphemus, jest jednym z najstarszych stworzeń na Ziemi, a zwierzę to nadal odgrywa niezastąpioną rolę w badaniach biomedycznych. Nie tylko ich krew zawiera specjalne komórki, których naukowcy używają do wykrywania bakteriotoksyn w lekach, ale ich oczy zawierają również sieć neuronową, która dostarczyła wielu informacji na temat procesów fizjologicznych zachodzących w naszym systemie wzrokowym, takich jak adaptacja do światła i inhibicja boczna. Krab podkucie pozostaje atrakcyjnym modelem w badaniach nad wzrokiem, ponieważ zwierzę to jest duże i wytrzymałe jak na bezkręgowca, jego neurony siatkówkowe są duże i łatwo dostępne, system wzrokowy jest kompaktowy i szeroko przebadany, a zachowanie wizualne jest dobrze zdefiniowane. Ponadto struktura i funkcja oczu są modulowane na co dzień przez zegar okołodobowy w mózgu zwierzęcia. Krótko mówiąc, system wzrokowy krabów podkucie jest wystarczająco prosty, by można go było zrozumieć, a jednocześnie na tyle złożony, by był interesujący.

W tym filmie przedstawiamy trzy paradygmaty elektrofizjologiczne służące do badania neuronowych podstaw widzenia, które można przeprowadzić in vivo u Limulus. Są to: rejestracja elektroretinogramu, rejestracja z nerwu wzrokowego oraz rejestracja wewnątrzsiatkówkowa. Rejestracja elektroretinogramu (ERG) pozwala zmierzyć za pomocą elektrody powierzchniowej sumaryczną odpowiedź elektryczną wszystkich komórek oka na błysk światła. Można ją wykorzystać do monitorowania ogólnej wrażliwości oka przez dłuższy czas. Rejestracja z nerwu wzrokowego mierzy aktywność impulsową pojedynczych włókien nerwowych za pomocą zewnątrzkomórkowej mikroelektrody ssącej. Metoda ta pozwala badać sygnały wzrokowe przesyłane z oka do mózgu, a także sygnały zegara okołodobowego przesyłane zwrotnie z mózgu do oka. Rejestracja wewnątrzsiatkówkowa mierzy za pomocą mikroelektrody wewnątrzkomórkowej wahania napięcia indukowane światłem w poszczególnych komórkach oka. Może ona służyć do wyjaśniania mechanizmów komórkowych przetwarzania w siatkówce.

Protokół

Część 1: Przygotowanie eksperymentalne

Procedury eksperymentalne przeprowadzane na krabach podkowiastych zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na Uniwersytecie Bostońskim. Zwierzęta są pozyskiwane z Marine Biological Labs (Woods Hole, MA) lub od innego dostawcy i utrzymywane w napowietrzanym zbiorniku z wodą słoną w pomieszczeniu z regulowanym cyklem światła i ciemności. Reżim oświetlenia jest istotny dla synchronizacji zegara okołodobowego kraba oraz codziennego przełączania oka między stanem dziennym a nocnym. Bezpośrednio przed rozpoczęciem wszelkich procedur inwazyjnych zwierzę jest schładzane w wiadrze z lodem przez 10-15 minut, aż do spowolnienia jego ruchów, a następnie unieruchamiane na drewnianej platformie za pomocą dwóch śrub ze stali nierdzewnej wkręconych w prosomę i dwóch w opistosomę. Platforma jest dociążona od spodu granitem, aby zatonęła w wodzie. Po zakończeniu eksperymentów terminalnych zwierzę jest uśmiercane poprzez ponowne zanurzenie w zawiesinie lodowej i zniszczenie mózgu, znajdującego się nad otworem gębowym, za pomocą skalpela.

Część 2: Roztwory

Roztwór Ringera dla Limulus składa się z 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9,52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21,05 mM MgSO4, 50μM TES, 50μM HEPES oraz 10ml/L mieszaniny Pen-Strep (penicylina-streptomycyna, 10000 units/ml).

Część 3: Rejestracja elektroretinogramu

Narzędzia potrzebne do tej procedury obejmują śrubokręt, wazelinę, roztwór Ringera, pipetę transferową, zieloną diodę LED, komorę rejestracyjną, śruby ze stali nierdzewnej oraz patyczek kosmetyczny.

1. Do rejestracji ERG wykorzystuje się wykonaną ręcznie komorę (Rysunek 1A). Korpus komory jest zaprojektowany tak, aby utrzymywać rezerwuar z roztworem soli w kontakcie z okiem. Pokrywa zawiera drut z chlorku srebra służący do połączenia przewodzącego roztworu z wzmacniaczem oraz mały otwór dostosowany do rozmiaru diody LED. Najlepiej sprawdza się ultrajasna dioda LED z maksimum emisji w okolicach 520nm.
2. Na początku dolną część komory pokrywa się wazeliną i mocuje nad okiem za pomocą dwóch śrub.
3. Następnie komorę wypełnia się roztworem soli i zamyka pokrywą.
4. Po zamocowaniu komory kraba umieszcza się w klatce nieprzepuszczającej światła, w zbiorniku wypełnionym wodą morską tak, aby skrzela były zanurzone.
5. Kabel diody LED wprowadza się do pokrywy komory.
6. Przewód sygnałowy przypina się do drutu z chlorkiem, a przewód referencyjny do jednej z wszczepionych śrub.
7. Oba przewody podłącza się do stopnia wejściowego wysokoimpedancyjnego wzmacniacza różnicowego (X-cell 3x4, FHC Inc) w celu wzmocnienia sygnału, a filtr wzmacniacza ustawia się na przepuszczanie częstotliwości poniżej 10Hz.
8. Wyjście ze wzmacniacza kieruje się do oscyloskopu w celu wizualizacji oraz do karty akwizycji danych w celu analizy komputerowej i zapisu.
9. Po zakończeniu konfiguracji drzwi klatki zostają zamknięte, aby zablokować dostęp światła z pomieszczenia do zwierzęcia.
10. Dane są zbierane za pomocą dedykowanego programu napisanego w LabView. Program generuje błyski diody LED, rejestruje wywołany sygnał ERG i mierzy amplitudę odpowiedzi szczyt-szczyt. Wybór paradygmatu błysków zależy od celu eksperymentu. Na przykład krótki (100ms) impuls 5V przykładany do diody LED co 10 minut pozwala uniknąć efektów adaptacji do światła podczas monitorowania zmian dobowych w czułości oka.

Część 4: Rejestracja z nerwu wzrokowego

Narzędzia niezbędne do przeprowadzenia tej procedury obejmują śrubokręt, nić, trepan, roztwór Ringera, kleszczyki kostne, nożyczki Vanasa, komorę rejestracyjną, pęsetę zakrzywioną, cienkie sondy igłowe, tępy skalpel, nożyczki chirurgiczne oraz elektrodę ssącą.

1. Do rejestracji odpowiedzi nerwu wzrokowego wykorzystywana jest komora wykonana ręcznie (Rycina 1B). Wnętrze komory stanowi otwarta studzienka o średnicy 2 cm, która w dolnej ściance posiada cienki, półkolisty otwór szczelinowy, umożliwiający wprowadzenie nerwu i jego odizolowanie od otaczających tkanek.
2. Przed przymocowaniem komory między mięśnie zawiasowe do serca wprowadza się igłę o rozmiarze 16G i odprowadza z organizmu zwierzęcia ok. 20 cc krwi. Wykrwawienie nie jest konieczne, ale ułatwia dysekcję nerwu wzrokowego.
3. Położenie nerwu wzrokowego określa się poprzez narysowanie na karapaksie lekko zakrzywionej linii między okiem bocznym a środkowym.
4. Następnie w karapaksie wycina się otwór okrągły za pomocą trepanu. Otwór ma taką samą średnicę jak studzienka komory. Środek otworu znajduje się 2-3 cm przed okiem bocznym i nieco grzbietowo względem linii, tak aby nerw biegł wzdłuż brzusznej części studzienki.
5. Tkankę łączną usuwa się do momentu, aż nerw będzie w pełni widoczny i wolny od tkanek otaczających i podścielających.
6. Nitkę nici zapętla się wokół nerwu i przeciąga do komory przez otwór w dnie. Przez ten sam otwór nerw jest delikatnie wprowadzany do komory poprzez pociąganie za nitkę. Jednocześnie studzienka komory jest wkładana do otworu. Następnie komorę przytwierdza się do karapaksu za pomocą śrub, a studzienkę wypełnia się roztworem Ringera.
7. Po przymocowaniu komory zwierzę umieszcza się w nieprzepuszczającej światła klatce w zbiorniku wypełnionym wodą morską tak, aby woda zakrywała skrzela.
8. Studzienkę ogląda się pod stereomikroskopem (SMZ-168, Jed Pella Inc), a wokół otworu w dnie układa się watę, aby zapobiec wyciekowi krwi do wnętrza komory oraz wyciekowi soli fizjologicznej na zewnątrz.
9. Pozostałą tkankę łączną wokół nerwu usuwa się za pomocą precyzyjnych nożyczek i pęsety, a komorę ponownie wypełnia się świeżym roztworem Ringera.
10. Wykonuje się nacięcie w naczyniu krwionośnym otaczającym nerw, a przez ten otwór nerw jest ostrożnie odsłaniany z osłonki na całej jego długości przy użyciu precyzyjnych nożyczek, pęsety i sond igłowych.
11. Za pomocą sondy oddziela się niewielki pęczek włókien i przecina go na końcu najdalej oddalonym od oka w celu rejestracji włókien aferentnych lub na końcu najbliższym oku w celu rejestracji włókien eferentnych. Na filmie przecinany jest koniec przeznaczony do rejestracji włókien aferentnych.
12. Do rejestracji nerwu wzrokowego używa się mikroelektrody ssącej (A-M Systems Inc) wypełnionej roztworem Ringera. Końcówkę elektrody dopasowuje się do pęczka nerwowego poprzez wypalanie końcówki kapilary borokrzemowej o średnicy 1 mm.
13. Końcówkę elektrody opuszcza się do studzienki komory za pomocą manipulatora manualnego (WPI Inc), a przecięty pęczek włókien jest zasysany do końcówki. Ssanie jest generowane przez strzykawkę Gilmont połączoną z elektrodą za pomocą rurki.
14. Złącze BNC służy jako przewód sygnałowy, a drut z chlorkiem srebra owinięty wokół elektrody w celu redukcji szumów stanowi przewód referencyjny. Oba przewody są podłączone do stopnia wejściowego wzmacniacza różnicowego w celu wzmocnienia sygnału i filtrowania szumów (X-cell 3x4, FHC Inc). Wyjście wzmacniacza jest przesyłane do oscyloskopu w celu wizualizacji oraz do karty akwizycji danych w celu analizy komputerowej i zapisu.
15. Dane są gromadzone za pomocą dedykowanego programu napisanego w LabView. Program steruje bodźcami świetlnymi za pomocą cyfrowego procesora wideo (Bits++, Cambridge Research Systems Inc) i współpracuje z cyfrowym dyskryminatorem impulsów (APM, FHC Inc), który rejestruje serie impulsów. Światło może być dostarczane do pojedynczych komórek w oku za pomocą światłowodowego światłowodu lub do całego oka za pomocą sterowanego komputerowo wyświetlacza wideo.

Część 5: Rejestracja wewnątrzsiatkówkowa

Narzędzia niezbędne do przeprowadzenia tej procedury obejmują śrubokręt, platformę z lucytu w kształcie litery L z gwintowanymi otworami na śruby, uchwyt mikroelektrody z pipetą szklaną, śruby ze stali nierdzewnej, pęsetę oraz precyzyjny skalpel.

1. Do rejestracji odpowiedzi wewnątrzkomórkowych wykorzystuje się ręcznie wykonaną płytkę lucytową z przygotowanymi otworami na śruby. Rozmieszczenie otworów umożliwia montaż zmotoryzowanego mikromanipulatora (PPM5000, WPI Inc). Płytkę mocuje się do zwierzęcia za pomocą dwóch śrub bocznych i jednej górnej.
2. Po przymocowaniu płytki zwierzę umieszcza się w nieprzepuszczalnej dla światła klatce, w zbiorniku wypełnionym wodą morską ponad skrzela.
3. Mikropozycjoner przykręca się do płytki, ustawiając jego ruchome ramię nad okiem.
4. Partię szklanych mikropipet wyciąga się z borokrzemianowego szkła o średnicy zewnętrznej 1 mm, a końcówki wypełnia się roztworem 3M KCl poprzez działanie kapilarne, umieszczając mikropipety w małej fiolce z tym roztworem.
5. Pozostałą część pipet wypełnia się ręcznie roztworem soli i umieszcza w uchwycie elektrody.
6. Uchwyt elektrody jest połączony z głowicą wzmacniacza wewnątrzkomórkowego (IR-283, Cygnus Technology Inc) zamocowaną do ramienia mikropozycjonera.
7. Niewielki fragment siatkówki (~1mm2) odsłania się poprzez wycięcie warstwy rogówki za pomocą żyletki.
8. Na odsłoniętą siatkówkę nanosi się kroplę roztworu Ringera, aby zapobiec wysychaniu, a następnie wprowadza końcówkę mikropipety przez otwór do tkanki siatkówki.
9. W momencie wprowadzenia końcówki do roztworu uruchamia się tryb wstrzykiwania prądu we wzmacniaczu wewnątrzkomórkowym i mierzy impedancję elektrody. Mikropipety o impedancji poza zakresem 20-70 MW są odrzucane. Te znajdujące się w tym zakresie są przesuwane o mikrokroki i wprowadzane do komórek poprzez elektroniczne lub mechaniczne wibrowanie końcówki pipety.
10. W oku można napotkać trzy typy komórek. Komórki retinularne wykazują jedynie odpowiedź depolaryzującą na światło, komórki ekscentryczne wykazują serię potencjałów czynnościowych nałożonych na odpowiedź depolaryzującą, a komórki pigmentowe nie wykazują żadnej odpowiedzi na światło.
11. Dane są zbierane za pomocą dedykowanego programu napisanego w Labview. Program steruje bodźcami świetlnymi poprzez cyfrowy procesor wideo (Bits++, Cambridge Research Systems). Bodźce są dostarczane do wkłutych komórek za pomocą światłowodu lub wyświetlacza wideo. Odpowiedzi napięciowe obserwuje się na oscyloskopie, a następnie program digitalizuje je i przesyła do komputera.

Część 6: Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywny zapis ERG przedstawiono na rysunku 2A. Kształt fali reprezentuje sumaryczną odpowiedź elektryczną na światło głównie fotoreceptorowych komórek retinularnych, ponieważ znacznie przewyższają one liczebnością komórki ekscentryczne i są z nimi sprzężone elektrycznie. W przeciwieństwie do ERG u ssaków, nie występują tutaj liczne komponenty fali pochodzące od różnych typów komórek siatkówki. Sprzężenie zwrotne rytmu okołodobowego z zegarem w mózgu Limulus moduluje właściwości fizjologiczne komórek siatkówki w cyklu dobowym, co powoduje zmienność amplitudy i przebiegu czasowego ERG w czasie (1). Jak pokazano na rysunku 2B, amplituda ERG jest najwyższa podczas subiektywnej nocy zwierzęcia, a najniższa podczas subiektywnego dnia.

Reprezentatywny zapis odpowiedzi pojedynczego włókna nerwu wzrokowego na światło przedstawiono na Rysunku 3. Komórki ekscentryczne zachowują się w podobny sposób, wykazując przejściowy wzrost częstotliwości wyładowań impulsowych, po którym następuje spadek do poziomu stabilnego. Spadek częstotliwości odzwierciedla połączone działanie adaptacji do światła oraz zależnej od impulsów samohamowania w komórkach ekscentrycznych (2). Inne wzorce impulsów, takie jak zależne od światła spadki częstotliwości, obserwuje się w mózgu Limulus, ale nie w oku (3).

Reprezentatywne zapisy odpowiedzi napięciowej komórki pigmentowej, komórki retinularnej oraz komórki ekscentrycznej na światło przedstawiono na Rysunku 4. Tylko dwa ostatnie typy komórek siatkówki są komórkami wzrokowymi. Amplituda i przebieg czasowy ich odpowiedzi zależą od jakości rejestracji oraz położenia elektrody wewnątrz komórki. Zazwyczaj elektroda penetruje komórki pigmentowe lub komórki retinularne ze względu na ich duży rozmiar i liczbę. W przypadku tych ostatnich rejestrowana jest przejściowa depolaryzacja, która zanika do poziomu stacjonarnego. Zanik ten wynika z adaptacji do światła w komórkach retinularnych (2). Jeśli elektroda wejdzie do komórki ekscentrycznej, w aksonie rejestrowane są duże potencjały czynnościowe (40-70mV), a w pobliżu somy małe potencjały czynnościowe nałożone na falę depolaryzacyjną (<25mV).

Rycina 1. Schematy komór wykorzystywanych do rejestracji elektroretinogramu (A) oraz rejestracji z nerwu wzrokowego (B). Pasek odpowiada 7 mm w A i 5 mm w B.

Rycina 2. Przykładowy zapis ERG u Limulus wywołany 100ms impulsem LED o napięciu 5V w ciemności (A) oraz fluktuacja amplitudy ERG od szczytu do szczytu w czasie w stałej ciemności (B). Ciemność wprowadzono w czasie wskazanym przez biały trójkąt. Wzrost amplitudy ERG w czasie wskazanym przez czarny trójkąt wynika z adaptacji do ciemności, która zwiększa czułość oka w ciemności. Następująca po tym cykliczna zmienność amplitudy ERG jest spowodowana wewnętrznym zegarem okołodobowym zwierzęcia. Punkty czasowe w B są rozmieszczone co 5min.

Rycina 3. Przykładowy zapis odpowiedzi włókna nerwu wzrokowego na błysk światła skierowany na pojedynczy receptor ommatidialny. Kształt fali powyżej zapisu wskazuje czas trwania bodźca. Komórki ekscentryczne, których aksony tworzą włókna nerwowe, wykazują podobny wzorzec pobudzenia w warunkach oświetlenia zastosowanych w eksperymencie (błysk trwający 5sec w całkowitej ciemności). Kodowanie siatkówkowe za pomocą impulsów jest cechą, którą Limulus dzieli z ssakami, w przeciwieństwie do innych bezkręgowców.

Rysunek 4. Przykładowe zapisy odpowiedzi napięciowej na światło trzech typów komórek występujących w boczny oku Limulus: komórki pigmentowej (A), komórki retinularnej (B) oraz komórki ekscentrycznej (C). Pierwsza komórka jest niewzrokowa. Dwie pozostałe ulegają depolaryzacji po błysku światła. Depolaryzacja jest największa w przypadku komórek retinularnych, ponieważ to one przetwarzają światło i przesyłają sygnał poprzez połączenia szczelinowe do komórki ekscentrycznej, przy pewnej utracie sygnału po drodze. W komórce ekscentrycznej widoczne są potencjały czynnościowe generowane przez akson, które nakładają się na depolaryzację z powodu wstecznej propagacji impulsów do somy. Amplituda potencjałów czynnościowych została zmniejszona na rysunku w celu lepszej widoczności potencjału depolaryzacyjnego. Potencjał spoczynkowy komórek wynosi -50mV.

Dyskusja

Przedstawiliśmy sposób przeprowadzania rejestracji ERG, rejestracji z nerwu wzrokowego oraz rejestracji wewnątrzsiatkówkowych u krabów podkowiastych in vivo. Każda z technik rejestracji dostarcza innych informacji na temat neuronalnych podstaw widzenia, a dzięki dużym oczom i twardemu pancerzowi kraba wszystkie one mogą być wykorzystane do badania funkcji siatkówki u żywych zwierząt. Przy odpowiedniej konstrukcji elektrod aktywność nerwu wzrokowego można rejestrować nawet u zwierząt swobodnie zachowujących się w oceanie ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LED	Źródło światła	Newark Inc	33C1292
Elektroda ssąca	Elektroda	A-M Systems	573000
Wzmacniacz sygnałów pozakomórkowych XCell 3*4-Channel	Wzmacniacz	FHC, Inc.	40-40-8B
Rejestracja wewnątrzkomórkowa	Wzmacniacz	Cygnus	IR-283A
APM	Dyskryminator impulsów neuronalnych	FHC, Inc.	APM
Bits++	Tablica wideo	Cambridge Research Systems	Bits++
Manipulator Piezopatch	Mikropozycjoner	World Precision Instruments, Inc.	PPM5000
Stymulator impulsów prostokątnych	Stymulator nerwu	Technologie traw	Model S48
P-97	Wytciągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	Model P-97
Kapilara z borokrzemianowego szkła	Szkło elektrodowe	World Precision Instruments, Inc.	1B150-4
Konie– krab (Limulus polyphemus)	Zwierzę	Marine Biological Laboratories
Wytwornica mikroelektrod (mikropipet)	Wytokarka do szkła	Sutter Instrument Co.	P-97
Stereomikroskop z zoomem	Mikroskop	Jed Pella Inc.	SMZ-168