Opisujemy in vivo protokół obrazowania fluorescencyjnego służący do monitorowania regeneracji mięśni za pomocą mioblastów znakowanych białkiem GFP po transplantacji do mięśni szkieletowych myszy zdrowych oraz dystroficznych. Protokół ten można zaadaptować do badania regeneracji mięśni poprzez transplantację innych typów komórek, a także w innych stanach chorobowych mięśni.
Artykuł metodologiczny
Śledzenie dynamiki wszczepiania mięśni u małych zwierząt za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dystrofie mięśniowe stanowią grupę degeneracyjnych chorób mięśni charakteryzujących się postępującą utratą kurczliwych komórek mięśniowych. Obecnie nie istnieje dostępna metoda leczenia przyczynowego. Ostatnie postępy w biologii komórek macierzystych dają nową nadzieję na opracowanie skutecznych terapii komórkowych w leczeniu tych schorzeń. W tej dziedzinie szeroko stosuje się transplantację różnych typów komórek macierzystych znakowanych białkami fluorescencyjnymi do mięśni dystroficznych modeli zwierzęcych. Nieinwazyjna technika umożliwiająca podłużne śledzenie losów przeszczepionych komórek może usprawnić i zwiększyć dokładność oceny procesu wgryzania się komórek transplantowanych w tkankę mięśniową.
W niniejszym badaniu wykazujemy, że obrazowanie fluorescencyjne in vivo jest czułą i niezawodną metodą śledzenia przeszczepionych komórek znakowanych GFP (Green Fluorescent Protein) w mięśniach szkieletowych myszy. Pomimo obaw dotyczących tła wynikającego z konieczności użycia zewnętrznego światła do wzbudzenia białka fluorescencyjnego, stwierdziliśmy, że zastosowanie myszy nago lub usunięcie sierści za pomocą odczynników do depilacji w znacznym stopniu eliminuje ten problem. Przy użyciu kamery CCD sygnał fluorescencyjny można wykryć w mięśniu piszczelowym przednim (TA) po wstrzyknięciu 5 x 105 komórek pochodzących albo z transgenicznych myszy GFP, albo z hodowli mioblastów transdukowanych eGFP. W przypadku mięśni położonych bardziej powierzchownie, takich jak mięsień prostownik długi palców (EDL), wstrzyknięcie mniejszej liczby komórek generuje wykrywalny sygnał. Intensywność sygnału można zmierzyć i określić ilościowo jako liczbę fotonów emitowanych na sekundę w obszarze zainteresowania (ROI). Ponieważ uzyskane obrazy wykazują wyraźne granice wyznaczające obszar wszczepienia, można również zmierzyć wielkość ROI. Jeśli kończyny są za każdym razem pozycjonowane w ten sam sposób, zmiany w całkowitej liczbie fotonów na sekundę na mięsień oraz wielkość ROI odzwierciedlają zmiany w liczbie wszczepionych komórek i wielkości obszaru wszczepienia. Zatem zmiany w tym samym mięśniu w czasie są mierzalne ilościowo. Technika obrazowania fluorescencyjnego in vivo była stosowana głównie do śledzenia wzrostu komórek tumorigennych; nasze badanie wykazuje, że jest ona potężnym narzędziem, które umożliwia śledzenie losów przeszczepionych komórek macierzystych.
Protokół
Przygotowanie komórek
- Izolacja komórek satelitarnych
- Po podaniu środka znieczulającego usuwa się mięśnie kończyn myszy transgenicznych GFP (C57BL/ Ka-βactin-EGFP). Po pocięciu na małe kawałki komórki satelitarne są dysocjowane enzymatycznie poprzez inkubację posiekanego tkanki z 2% roztworem kolagenazy i dispazy przez 1 godzinę w 37°C.
- Trawienie enzymatyczne neutralizuje się pożywką wzrostową zawierającą Ham F-10 i 20% FBS, a następnie dysocjuje się mięśnie poprzez wielokrotne tryturację pipetą Pasteura. Komórki są filtrowane przez sito komórkowe (ø70-100μm), a następnie wysiewane na niepowlekaną szalkę na 1 godzinę w 37°C.
- Ostrożnie usuwa się nadsącz i wysiewa komórki na szalkę powleczoną kolagenem. Krok ten powtarza się po 1 godzinie w celu oczyszczenia mioblastów (pre-plating).
- Wymienia się pożywkę i wysiewa komórki w odpowiednim czasie. Ostatecznie oczyszczone mioblasty hoduje się w pożywce zawierającej Ham F-10, 20% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (pożywka wzrostowa) w 37°C przy 5% CO2 i 95% powietrza.
- Hodowanie i namnażanie pierwotnych mioblastów w pożywce wzrostowej z dodatkiem podstawowego FGF w stężeniu 10 ng/ml.
- W przypadku wszystkich eksperymentów in vivo wstrzykujemy 5x105 komórek na jeden mięsień TA.
- Podczas zbierania mioblastów odrywamy komórki, używając 0.25% trypsyny/EDTA, a następnie dwukrotnie przemywamy je PBS. Liczbę komórek określa się za pomocą hemocytometru, a następnie resuspensuje w HBSS do stężenia 5x104 komórek/μl. Skoncentrowane komórki w HBSS umieszcza się w lodzie i wstrzykuje w ciągu 1 godziny od zebrania.
In Vivo Obrazowanie
- Samce myszy mdx w wieku 4-6 tygodni są zamawiane z laboratorium Jackson i utrzymywane w zwierzęcym domu hodowlanym.
- Po około jednym tygodniu aklimatyzacji w nowym środowisku myszy są gotowe do implantacji hodowlanych komórek.
- Przed transplantacją komórek mysz poddaje się znieczuleniu poprzez dostrzyszkowe (i.p.) wstrzyknięcie mieszaniny Ketaminy (100 mg/kg) i Ksylazyny (10 mg/kg). Następnie usuwa się sierść z okolic mięśnia TA, nakładając preparat Nair na nogę i odczekując 30 sekund, po czym miejsce to przeciera się wodą destylowaną.
- Podczas gdy mysz nadal znajduje się pod wpływem znieczulenia, 5x105 komórek w 10μl HBSS są powoli wstrzykiwane do każdego mięśnia TA w 3 punktach za pomocą igły o rozmiarze 30G.
- Po kroku 4 mysz może być regularnie obrazowana za pomocą fluorescencyjnego obrazowania in vivo. Do uzyskania obrazów tylnych kończyn myszy wykorzystuje się stację do obrazowania fluorescencyjnego NightOwl LB981 (Berthold Technologies, Inc.), wyposażoną w wysokoczułą kamerę CCD.
- W dniu obrazowania in vivo sprawdzamy najpierw odrost sierści na mięśniu TA. W razie potrzeby ponownie stosujemy preparat Nair w celu usunięcia sierści, zgodnie z powyższym opisem, po znieczuleniu myszy mieszaniną Ketaminy i Ksylazyny.
- Gdy mysz jest pod wpływem znieczulenia, umieszczamy ją w pozycji brzusznej na arkuszu czarnego, niefluorescencyjnego papieru (czarny papier Artagain firmy Strathmore). Aby w pełni odsłonić mięsień TA dla lepszego obrazowania, przyklejamy tylne łapy do papieru taśmą.
- Umieszczamy mysz w komorze obrazującej i ustawiamy tylną nogę przeznaczoną do obrazowania w centrum pola widzenia kamery. Najpierw zmieniamy filtr emisyjny, aby wykonać tradycyjne zdjęcie nogi w skali szarości z czasem ekspozycji 5 sekund. W razie potrzeby korygujemy pozycję myszy oraz ostrość kamery. Parametry obrazowania, w tym czas ekspozycji (1,250 ms), wysokość próbki (0.9 cm) itp., pozostają stałe w całym procesie eksperymentalnym.
- Następnie włączamy odpowiedni filtr emisyjny dla długości fali zielonego białka fluorescencyjnego. Wykonujemy obraz fluorescencyjny z czasem ekspozycji 1,250 ms i binningiem równym 1. Po obrazowaniu mysz zostaje przeniesiona z komory obrazującej do klatki w celu wybudzenia.
- Do analizy wyznaczamy obszar zainteresowania (ROI) nad sygnałami fluorescencyjnymi, aby zmierzyć ich intensywność w jednostkach fotonów na sekundę. Jako kolejną wartość ilościową mierzymy rozmiar ROI w liczbie pikseli. Eksperymenty obrazowe mogą być powtarzane co tydzień lub częściej przez kilka miesięcy, jeśli jest to konieczne, w celu pozyskania danych podłużnych.
Po zakończeniu eksperymentów mysz zostaje poddana eutanazji, a mięsień TA zostaje pobrany do analizy histologicznej.
Dyskusja
W niniejszym badaniu opracowaliśmy niezawodną i stabilną platformę obrazowania do śledzenia znakowanych fluorescencyjnie komórek przeszczepionych do mięśnia szkieletowego biorcy. Mioblasty znakowane GFP pochodzące od transgenicznej myszy GFP reprezentują rodzaj dorosłych komórek macierzystych, które w przyszłości będą kandydatami do terapii komórkowej. Stała kontrola parametrów, w tym liczby komórek, sposobu wstrzykiwania komórek, czystości tła, pozycji obrazowania oraz parametrów urządzenia, jest kluczowa dla uzyskania wysokiej jakości obrazów, a w szczególności dla analizy ilościowej.
Obrazowanie fluorescencyjne znajduje wiele zastosowań w badaniach biomedycznych, ponieważ jest nieinwazyjne, łatwe w użyciu i charakteryzuje się wysoką przepustowością. Ponadto obrazowanie fluorescencyjne może zapewniać pomiar ilościowy oparty na liczbie fotonów, choć ze względu na rozpraszanie, tłumienie i absorpcję światło nie może przenikać na duże odległości w tkance, co stanowi wadę tej techniki. Podejmowane są wysiłki w celu wykorzystania reporterów czerwonych lub bliskiej podczerwieni, aby zwiększyć głębokość penetracji światła.
Kolejną zaletą obrazowania fluorescencyjnego jest możliwość jego przeniesienia do praktyki klinicznej, pod warunkiem że konkretny reporter fluorescencyjny zostanie zatwierdzony do stosowania u ludzi. W porównaniu z MRI, CT i PET, obrazowanie fluorescencyjne charakteryzuje się dużą elastycznością, ponieważ nie wymaga drogiego sprzętu ani środków kontrastowych. Przykładem są endoskopy i mikroendoskopy oparte na fluorescencji, które są wykorzystywane w klinikach. Łącząc obrazowanie fluorescencyjne z innymi modalnościami, spodziewamy się uzyskać możliwość pozyskiwania zarówno informacji anatomicznych, jak i funkcjonalnych na temat zachodzących procesów biologicznych.
Podziękowania
Prace Z. Yang i Y. Wang były możliwe dzięki grantowi K02 AR051181 z NIAMS/NIH oraz grantom z Muscular Dystrophy Association i Harvard Stem Cell Institute dla Y. Wang. Prace Q. Zeng i X. Xu są wspierane przez grant programowy przyznany Optical Imaging Lab przez Brigham and Women’s Hospital. Autorzy chcieliby podziękować Wen Liu z Department of Anesthesia, BWH, za pomoc techniczną przy pracy z komórkami.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
Bibliografia
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).
- Green, fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. Three-dimensional fluorescence lifetime tomography. Med Phys. 32, 992-1000 (2005).
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 Forthcoming.
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
Przedruki i uprawnienia
