$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Przygotowanie odczynników
Przygotuj bufor do PIPES (80 mM PIPES, 1mM MgCl2, 1mM EGTA, dostosowane do pH 6.8 z KOH). Podwielokrotność i przechowywanie oksydazy glukozowej, katalazy i glukozy w temperaturze -70°C, a taksolu w temperaturze -20°C zgodnie z istniejącymi protokołami. 1,2 Podwielokrotność i przechowywać tubulinę w temperaturze -70 °C zgodnie z instrukcją dołączoną przez dostawcę.
Wzór mikroelektrod Au za pomocą litografii
- Pokrój wafle krzemowe na podłoża o grubości 1 cm ' 1,5 cm za pomocą rysika lub noża do wafli. Oczyść podłoża, umieszczając je w zlewce z wystarczającą ilością acetonu, aby je przykryć i sonikować przez 5 minut. Nie dopuszczając do wyschnięcia podłoży, opłucz je świeżym acetonem, a następnie natychmiast spłucz w izopropanolu i wysusz azotem.
- Mikroelektrody Au należy wykonać na czystych podłożach przy użyciu standardowej fotolitografii o dodatnim tonie lub litografii wiązką elektronów, w zależności od wielkości pożądanych cech. 3 Projektując geometrię wzoru, utrzymuj średnicę każdego wzoru elektrody poniżej 100 mikronów, aby zapewnić pokrycie przez PEG SAM (opisany w następnym rozdziale). Zawiera podkładki kontaktowe (~ 300 mm
2) umieszczone w odległości od 300 do 500 mm od wzoru za pomocą linii 1 mm łączącej podkładkę z elektrodą (rys. 1). Umieść wzory litograficzne w pobliżu środka podłoża, aby zapewnić miejsce wokół wzoru do montażu komory przepływowej.
Figure 1. Przykładowa geometria. Proszę kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję rysunku 1.
- Po opracowaniu wzoru w warstwie rezystancyjnej należy za pomocą pęsety narysować linię w rezyście od podkładki kontaktowej do krawędzi podłoża (rys. 1). Po osadzeniu metalu rysa umożliwi kontakt elektryczny między elektrodą a krawędzią podłoża. Do osadzania warstwy metalu służy komora osadzania, najlepiej z dwoma źródłami. Elektrody są formowane przez osadzanie 2 nm Cr (dla adhezji), a następnie 6 nm Au, bez przerywania próżni. Mikrowaga kryształu kwarcu wyposażona w komorę może być używana do pomiaru grubości warstw podczas osadzania.
Przygotuj SAM
- Rozgrzej i rozgrzej w dobrze wentylowanym miejscu do temperatury 75°C. Przygotuj roztwór silanizacyjny, dodając 20 ml toluenu do szklanej zlewki o pojemności 250 ml. Następnie dodać 1 ml PEG-silanu (tj. 5% v/v) do toluenu za pomocą plastikowej pipety. Wymieszaj dobrze PEG-silan, pipetując w górę i w dół od 5 do 10 razy, a następnie mieszając pipetą przez 30 sekund.
- Umieścić wzorzyste próbki w zlewce wzorzystą stroną skierowaną do góry, upewniając się, że są całkowicie zanurzone w roztworze toluenu PEG-silan i są równomiernie rozmieszczone na dnie zlewki. Wstaw zlewkę do piekarnika i piecz przez 18 do 21 godzin w temperaturze 75°C. Podczas formowania SAM przygotuj przeciwelektrodę (patrz poniżej) i zmontuj wszelkie dodatkowe elementy wymagane do pozostałych etapów.
- Po 18-21 godzinach w piecu toluen powinien odparować, pozostawiając wzorzyste próbki w lepkiej pozostałości PEG-silanu. Dodać 20 ml toluenu do zlewki i moczyć próbki przez 1-2 minuty. Wyjąć próbki ze zlewki i spłukać toluenem, następnie izopropanolem, a na koniec osuszyć azotem. W tym momencie próbki powinny wyglądać na czyste, a warstwa SAM powinna być niewidoczna gołym okiem. Tak przygotowane SAM-y nadają się do użytku przez okres do dwóch dni, jeśli są przechowywane w chłodnych, suchych warunkach (25 °C, umiarkowana wilgotność). Nieudane tworzenie SAM powoduje powstawanie mętnej lub nierównomiernie zabarwionej powłoki pozostałościowej na powierzchni.
Wyprodukuj przeciwelektrodę
W tej samej komorze do osadzania, która służy do osadzania mikroelektrod, wykonaj przeciwelektrodę, umieszczając 1 nm Cr, a następnie 4 nm Au na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 x 50 mm nr 1 lub nr 0. Przeciwelektroda powinna być prawie przezroczysta z jasnoszarym lub różowym odcieniem. Przechowuj przeciwelektrodę pokrytą stroną do góry na szalce Petriego, aby utrzymać ją w czystości.
Polimeryzacja tubuliny do MT
- Rozmrozić nieznakowaną tubulinę i tubulinę rodaminy i natychmiast połączyć w stosunku 1:2 znakowaną do nieznakowanej, aby uzyskać jasne MT. Wymieszać, pipetując kilkakrotnie w górę iw dół. Polimeryzować tubulinę przez 20-40 minut w podgrzewanej łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Długość MT będzie większa w przypadku dłuższych czasów polimeryzacji. Podczas polimeryzacji tubuliny należy przygotować bufor PIPES-taksol, dodając taksol do 20 mM do probówki mikrowirówkowej zawierającej bufor PIPES. Dobrze wymieszać taksol, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół i wirując, a następnie umieścić probówkę w podgrzewanej łaźni o temperaturze 37°C. Po polimeryzacji rozcieńczyć MT w stosunku 1/100 w ciepłym buforze PIPES-taksol i osłonić przed światłem. Tak przygotowane MT z czasem ulegną wydłużeniu i wiązce, którą można zmniejszyć poprzez dalsze rozcieńczanie.
- Przygotuj 10-krotną mieszaninę oczyszczającą tlen (OS), łącząc 30 ml zimnego buforu do rur (0-4°C), 5 ml 50% 2-merkaptoetanolu, 5 ml oksydazy glukozowej, 5 ml katalazy i 5 ml glukozy. 2 Glukoza powinna być dodawana na końcu. Mieszać, pipetując w górę i w dół 3-5 razy po dodaniu każdego składnika. Umieść mieszaninę OS na lodzie; Będzie działał przez około 2 godziny.
- Sprawdź, czy polimeryzacja MT powiodła się i czy MT są stabilne pod wpływem kilku minut wzbudzenia fluorescencyjnego, obrazując przygotowane MT z mieszanką 1x OS. Do obrazowania tak przygotowanych MT należy użyć kombinacji filtrów wzbudzenia/emisji odpowiedniej dla fluorescencji rodaminy. Określ najlepsze rozcieńczenie robocze do obrazowania pojedynczych włókien, dodatkowo rozcieńczając MT od 1/10 do 1/100 za pomocą bufora PIPES i obrazowania za pomocą 1x OS mix.
- Przygotuj komorę przepływową, umieszczając duże (22 x 50 mm) i małe (22 x 22 mm) szklane szkiełko nakrywkowe z dwoma kawałkami taśmy dwustronnej umieszczonymi w odległości 2-3 mm od siebie. Taśmę można łatwo pociąć na paski, umieszczając ją na szklanym szkiełku i przecinając żyletką. Wprowadzić kilka mikrolitrów MT do komory przepływowej za pomocą mikropipety. W przypadku obrazowania w dużym powiększeniu mogą być wymagane obiektywy o dużej odległości roboczej do obrazowania górnej powierzchni komory przepływowej. Odległość od powierzchni szkiełka nakrywkowego/próbki do górnej powierzchni komory przepływowej zależy od grubości taśmy i powinna wynosić 60-100 mm.
Wzór MT za pomocą elektroforezy
- Przygotuj komorę do elektroforezy, umieszczając dwa cienkie paski taśmy dwustronnej w poprzek wzorzystej próbki pokrytej SAM w taki sposób, aby elektroda znajdowała się między paskami, a ścieżka łącząca biegła prostopadle do taśmy (rys. 2). Umieść przeciwelektrodę na taśmie dwustronnej tak, aby metalowa strona stykała się z taśmą tak, aby krawędź próbki wystawała poza przeciwelektrodę na około 3 mm (rys. 2). Odetnij kilka 15 cm odcinków izolowanego miedzianego drutu magnetycznego i zdejmij 1 cm izolacji z obu końców. Przymocuj drut do odsłoniętego obszaru Au podłoża za pomocą małej kropli srebrnej farby, uważając, aby nie doszło do kontaktu elektrycznego z przeciwelektrodą (można to sprawdzić za pomocą multimetru). Podłącz drugi przewód do przeciwelektrody za pomocą srebrnej farby. Przewody przymocowane srebrną farbą można dodatkowo przymocować do próbek za pomocą taśmy.
Rysunek 2. Zespół komory przepływowej do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Proszę kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku 2.
- Wprowadzić MT w pożądanym rozcieńczeniu za pomocą buforu PIPES w połączeniu z OS przy 1-krotnym stężeniu końcowym. Obraz w 20-krotnym powiększeniu i zlokalizuj wzór na płytce krzemowej przed przyłożeniem napięcia. Opcjonalnie komora przepływowa może być uszczelniona za pomocą lakieru do paznokci, aby zapobiec przepływowi płynu i migracji MT w płaszczyźnie komory przepływowej.
- Zastosować napięcie do 1 V i obserwować migrację MT. Niższe napięcia (do około 0,5 V) mogą być stosowane, jeśli pożądane jest odwracalne uwięzienie MT, jednak wymaga to uszczelnienia komory przepływowej, aby zapobiec bocznemu dryfowaniu. Lakier do paznokci dobrze sprawdza się do uszczelniania otwartych końców komory przepływowej. Przy napięciach powyżej około 0,7 V na wzorcu może być widoczna pewna przyczepność MT, choć będzie ona słaba. Przy napięciach powyżej około 0,9 V migracja MT będzie szybsza, a adhezja silniejsza. Powyżej około 1,2 V prawdopodobieństwo wywołania elektrolizy (tworzenia się pęcherzyków gazu), a także zniszczenia mikroelektrod, znacznie wzrasta. Migrację można śledzić, dostosowując pionową płaszczyznę ostrości mikroskopu. Jeśli zostanie to przeprowadzone prawidłowo, MT zostaną zlokalizowane na powierzchniach elektrod.
