Przedstawiamy procedurę tworzenia samoorganizującej się monowarstwy z poli(glikolu etylenowego) (PEG-SAM) na podłożu krzemowym z mikroelektrodami złotymi. Warstwa PEG-SAM jest tworzona w jednym kroku i zapobiega biofoulingowi na powierzchniach krzemu oraz złota. Następnie wykorzystuje się elektroforezę do rozmieszczania biomolekuł w skali nanometrycznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Antyfouling samoorganizujące się monowarstwy na mikroelektrodach do wzorcowania biomolekuł
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przedstawiamy procedurę tworzenia samoorganizującej się monowarstwy (SAM) z trimetoksysilanu poli(glikolu etylenowego) (PEG) na podłożu krzemowym z mikroelektrodami złoconymi. PEG-SAM jest tworzona w jednym kroku montażu i zapobiega biofoulingowi na powierzchniach krzemu i złota. Monowarstwa służy do powlekania mikroelektrod uformowanych za pomocą standardowej litografii pozytywowej. Na przykładzie mikrotubul przykładamy napięcie stałe (DC), aby wywołać odwracalną migrację elektroforetyczną do elektrody powleczonej SAM. Do obrazowania migracji elektroforetycznej i wzorowania mikrotubul wykorzystywana jest komora przepływowa.in situz wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w tworzeniu wzorów biomolekularnych, ponieważ wykorzystuje elektroforezę do unieruchomienia cząsteczek docelowych, a tym samym nie wymaga specyficznych oddziaływań molekularnych. Ponadto pozwala ona uniknąć problemów występujących podczas prób bezpośredniego tworzenia wzorów z cząsteczek SAM za pomocą technik litograficznych. Kompatybilność z litografią wiązką elektronów umożliwia zastosowanie tej metody do tworzenia wzorów biomolekularnych w nanoskali.
Protokół
Przygotowanie odczynników
Przygotować bufor PIPES (80 mM PIPES, 1mM MgCl2, 1mM EGTA, pH skorygowane do 6,8 za pomocą KOH). Odważyć i przechowywać oksydazę glukozową, katalazę oraz glukozę w temperaturze -70°C, a taksol w temperaturze -20°C zgodnie z obowiązującymi protokołami.1,2 Odważyć i przechowywać tubulinę w temperaturze -70°C zgodnie z instrukcją dostawcy.
Wytrawianie mikroelektronod Au za pomocą litografii
- Potnij wafle krzemowe na podłoża o wymiarach 1 cm × 1,5 cm, używając rysika lub przecinarki do wafli. Oczyść podłoża, umieszczając je w zlewce z ilością acetonu wystarczającą do ich całkowitego zakrycia, a następnie poddaj sonikacji przez 5 minut. Nie pozwalając podłożom wyschnąć, wypłucz je w świeżym acetonie, następnie natychmiast wypłucz w izopropanolu i wysusz azotem.
- Wykonaj złote mikroelektrody (Au) na czystych podłożach, stosując standardową fotolitografię pozytywową lub litografię wiązką elektronów, w zależności od pożądanego rozmiaru struktur.3 Projektując geometrię wzoru, zachowaj średnicę każdego wzoru elektrody poniżej 100 µm, aby zapewnić pokrycie przez PEG SAM (opisane w następnej sekcji). Uwzględnij pady kontaktowe (~ 300 mm2) umieszczone w odległości od 300 do 500 µm od wzoru, z linią o szerokości 1 µm łączącą pad z elektrodą (Ryc. 1). Umieść wzory litograficzne w pobliżu środka podłoża, aby pozostawić wokół nich miejsce na montaż komory przepływowej.
Rycina 1. Przykładowa geometria. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1. - Po wywołaniu wzoru w warstwie rezystu, wydrap pęsetą linię w rezystcie od pada kontaktowego do krawędzi podłoża (Ryc. 1). Po osadzeniu metalu zadrapanie to umożliwi kontakt elektryczny między elektrodą a krawędzią podłoża. Do osadzania warstwy metalu należy użyć komory osadzania, najlepiej z dwoma źródłami. Elektrody tworzy się poprzez osadzenie 2 nm Cr (dla zapewnienia adhezji), a następnie 6 nm Au, bez przerywania próżni. Do pomiaru grubości warstw podczas osadzania można wykorzystać zamontowaną w komorze mikro-wagę kwarcową.
Przygotowanie SAM
- Rozgrzej piekarnik w dobrze wentylowanym pomieszczeniu do 75°C. Przygotuj roztwór do silanizacji, wlewając 20 mL toluenu do szklanego zlewka o pojemności 250 mL. Następnie za pomocą plastikowej pipety dodaj do toluenu 1 mL PEG-silanu (tj. 5% v/v). Dobrze wymieszaj PEG-silan, pobierając i wypuszczając ciecz pipetą od 5 do 10 razy, a następnie mieszając pipetą przez 30 sekund.
- Umieść wzorowane próbki w zlewce stroną wzorowaną do góry, upewniając się, że są całkowicie zanurzone w roztworze PEG-silanu w toluenie i równomiernie rozmieszczone na dnie zlewki. Wstaw zlewkę do piekarnika i wypalaj od 18 do 21 godzin w temperaturze 75°C. Podczas formowania się SAM, przygotuj przeciwelektrodę (patrz poniżej) oraz złóż wszystkie dodatkowe komponenty wymagane do pozostałych etapów.
- Po 18–21 godzinach w piekarniku toluen powinien odparować, pozostawiając wzorowane próbki w lepkim osadzie z PEG-silanu. Dolej do zlewki 20 mL toluenu i mocz próbki przez 1–2 minuty. Wyjmij próbki ze zlewki i opłucz je toluenem, następnie izopropanolem, a na koniec osusz azotem. Na tym etapie próbki powinny wyglądać na czyste, a warstwa SAM powinna być niewidoczna gołym okiem. SAMy przygotowane w ten sposób można wykorzystywać do dwóch dni, przechowując je w chłodnych i suchych warunkach (25 °C, umiarkowana wilgotność). Niepowodzenie w formowaniu SAM objawia się mętną lub nierównomiernie zabarwioną powłoką osadu na powierzchni.
Wytwarzanie przeciwelektrody
W tym samym układzie komory naparnej, który został wykorzystany do nanoszenia mikroelektrod, przygotuj przeciwelektrodę, nanosząc 1 nm Cr, a następnie 4 nm Au na szklaną lamellę nr 1 lub nr 0 o wymiarach 22 x 50 mm. Przeciwelektroda powinna być niemal przezroczysta, z jasnoszarym lub różowym odcieniem. Przechowuj przeciwelektrodę w szalce Petriego stroną z powłoką do góry, aby utrzymać ją w czystości.
Polimeryzacja tubuliny w mikrotubule (MTs)
- Rozmrozić tubulinę nieznakowaną oraz tubulinę znakowaną rodaminą i niezwłocznie połączyć je w stosunku 1:2 (znakowana do nieznakowanej), aby uzyskać jasne mikrotubule (MT). Pomieszać, pipetując próbkę w górę i w dół kilka razy. Polimeryzować tubulinę przez 20-40 minut w ciepłej kąpieli wodnej w temperaturze 37°C. Dłuższy czas polimeryzacji spowoduje uzyskanie dłuższych MT. Podczas polimeryzacji tubuliny przygotować bufor PIPES-taxol, dodając taxol do stężenia 20 mM do probówki do mikrocentryfugi zawierającej bufor PIPES. Dokładnie wymieszać taxol, pipetując w górę i w dół kilka razy oraz wierzchołkując (vortexing), a następnie umieścić probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Po polimeryzacji rozcieńczyć MT 1/100 w ciepłym buforze PIPES-taxol i chronić przed światłem. MT przygotowane w ten sposób będą z czasem wydłużać się i tworzyć wiązki, co można ograniczyć poprzez dalsze rozcieńczenie.
- Przygotować 10x mieszaninę usuwającą tlen (OS), łącząc 30 mL zimnego buforu PIPES (0-4°C), 5 mL 50% 2-merkaptoetanolu, 5 mL oksydazy glukozowej, 5 mL katalazy oraz 5 mL glukozy.2 Glukozę należy dodać na końcu. Mieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół 3-5 razy po dodaniu każdego składnika. Umieścić mieszaninę OS na lodzie; pozostanie ona aktywna przez około 2 godziny.
- Potwierdzić poprawność polimeryzacji MT oraz ich stabilność podczas kilku minut wzbudzania fluorescencyjnego, obrazując przygotowane MT z dodatkiem 1x mieszaniny OS. Do obrazowania MT przygotowanych w ten sposób należy użyć kombinacji filtrów wzbudzania/emisji odpowiedniej dla fluorescencji rodaminy. Ustalić optymalne rozcieńczenie robocze do obrazowania pojedynczych filamentów, rozcieńczając MT dalej w zakresie od 1/10 do 1/100 za pomocą buforu PIPES i obrazując je z dodatkiem 1x mieszaniny OS.
- Przygotować komorę przepływową, łącząc dużą (22 x 50 mm) i małą (22 x 22 mm) szklaną lamelkę za pomocą dwóch kawałków dwustronnej taśmy umieszczonych w odległości 2-3 mm od siebie. Taśmę można łatwo pociąć w paski, kładąc ją na szkiełku przedmiotowym i rozcinając żyletką. Wprowadzić kilka mikrolitrów MT do komory przepływowej za pomocą mikropipety. Do obrazowania przy dużym powiększeniu mogą być wymagane obiektywy o dużej odległości roboczej, aby obrazować górną powierzchnię komory przepływowej. Odległość od lamelki/powierzchni próbki do górnej powierzchni komory przepływowej jest określona przez grubość taśmy i powinna wynosić 60-100 mm.
Analiza wzorców MT za pomocą elektroforezy
- Przygotuj komorę elektroforetyczną, naklejając dwa wąskie paski dwustronnej taśmy na wzorowany materiał próbkowy pokryty SAM w taki sposób, aby elektroda znajdowała się pomiędzy paskami, a ścieżka połączenia biegła prostopadle do taśmy (Rys. 2). Umieść przeciwelektrodę na dwustronnej taśmie stroną metalową do taśmy, tak aby krawędź próbki wystawała poza przeciwelektrodę o około 3 mm (Rys. 2). Odetnij kilka odcinków izolowanego miedzianego drutu magnetowego o długości 15 cm i zdejmij 1 cm izolacji z obu końców. Przymocuj jeden drut do odsłoniętego obszaru Au podłoża za pomocą małej kropli farby srebrnej, uważając, aby nie doprowadzić do kontaktu elektrycznego z przeciwelektrodą (można to sprawdzić za pomocą multimetru). Przymocuj drugi drut do przeciwelektrody za pomocą farby srebrnej. Druty przymocowane farbą srebrną można dodatkowo zabezpieczyć na próbkach za pomocą taśmy.
Rycina 2. Montaż celi przepływowej dla odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2. - Wprowadź MT w pożądanym rozcieńczeniu, używając buforu PIPES w połączeniu z OS w końcowym stężeniu 1x. Wykonaj obrazowanie przy powiększeniu 20X i zlokalizuj wzór na waflu krzemowym przed przyłożeniem napięcia. Opcjonalnie komorę przepływową można uszczelnić lakierem do paznokci, aby zapobiec przepływowi cieczy i migracji MT w płaszczyźnie komory przepływowej.
- Przyłoż napięcie do 1 V i obserwuj migrację MT. Niższe napięcia (do około 0,5 V) mogą być stosowane w przypadku chęci odwracalnego uwięzienia MT; wymaga to jednak uszczelnienia komory przepływowej w celu zapobiegania dryftowi bocznemu. Lakier do paznokci dobrze sprawdza się przy uszczelnianiu otwartych końców komory przepływowej. Przy napięciach powyżej około 0,7 V może być widoczna pewna adhezja MT do wzoru, choć będzie ona słaba. Przy napięciach powyżej około 0,9 V migracja MT będzie szybsza, a adhezja silniejsza. Powyżej około 1,2 V znacznie wzrasta prawdopodobieństwo wywołania elektrolizy (tworzenia pęcherzyków gazu), a także zniszczenia mikroelektrod. Migrację można śledzić, regulując pionową płaszczyznę ostrości mikroskopu. Jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo, MT zlokalizują się na powierzchniach elektrod.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Migrację MT można łatwo zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ze względu na ich jasność oraz niską fluorescencję tła. Metoda ta ma ogólne zastosowanie w wzorcowaniu biomolekuł, ponieważ wymaga jedynie, aby biomolekuły uzyskały ładunek wypadkowy poprzez odpowiednią regulację pH buforu. W tej konfiguracji uniknięto elektroosmozy, ponieważ nie występują naładowane powierzchnie, takie jak ścianki krzemionkowe stosowane w elektroforezie kapilarnej.
Możliwe są liczne modyfikacje tej ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Melissie Grunlan za pomocne dyskusje na temat tworzenia SAM. Badania te były częściowo wspierane przez Robert A. Welch Foundation (A-1585).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-[metoksypoli-(etylenoooksy)propyl]-trimetoksysilan (PEG-silan) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | 6-9 jednostek PEG; masa cząsteczkowa 450-600 g mol-1 |
| 2-merkapt–etanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Aceton | EMD Millipore | AX0120-8 | stopień czystości ACS |
| Katalaza | Calbiochem | 219001-5MU | |
| Chlorobenzen | EMD Millipore | MK441908 | stopień czystości ACS |
| Glikol etylenowy-bis(2-amino–etyloeter)-N,N,N’,N’-kwas tetraoctowy (EGTA) | Calbiochem | 324626 | |
| Glukoza | EMD Millipore | DX0145-1 | |
| Oksydaza glukozowa | MP Biomedicals | 100330 | |
| Guanozyna-5’-[(α,Β)-metyleno]trifosforan, sól sodowa (GMPCPP) | Jena Biosciences, GmbH | NU-405s | |
| Guanozyna-5’-trifosforan | Sigma-Aldrich | G8752 | |
| Izopropanol | EMD Millipore | PX1835-5 | stopień czystości ACS |
| Metylizobutylo-keton (MIBK) | Fisher Scientific | AC12739-0010 | |
| Paklitaksel (taxol) | Calbiochem | 580555 | |
| Piperazyna-N,N’’-bis(2-etanosulfonowy kwas) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| Polimetylometakrylan (PMMA) | Brewer Science, Inc. | 950K | masa cząsteczkowa 950K |
| Rodamina-tubulina | Cytoskeleton, Inc. | T331M | z mózgu bydlęcego, czystość 99%, liofilizowana |
| Toluen | EMD Millipore | TX0735-5 | stopień czystości ACS |
| Tubulina | Cytoskeleton, Inc. | T238 | z mózgu bydlęcego, czystość 99%, liofilizowana |
Szklane pipety nakrywkowe z borokrzemianu nr 1 (22 X 50 mm) zakupiono w VWR. Polerowane wafle krzemowe typu p o orientacji <111> klasy elektronicznej zakupiono w Addison Engineering, Inc. Wysokiej czystości farbę srebrną otrzymano z Structure Probe, Inc. (Katalog # 5001 AB). Izolowany miedziany drut magnetyczny o cienkim przekroju (średnica ~ 0.08 mm (0.003”)) można nabyć od dostawców komponentów elektronicznych. |
Bibliografia
- Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html (2009).
- Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html (2009).
- Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
