Wysokoprzepustowa metoda krio konserwacji plemników i zapłodnienia in vitro ryby danio-ostreokonicznej (zebrafish)

Podsumowanie

Jest to protokół wysokoprzepustowej krio konserwacji plemników rybek zebrafish. Plemniki krio konserwowane zgodnie z tym protokołem wykazują średnią płodność na poziomie 25% podczas późniejszego zapłodnienia in vitro i pozostają stabilne przez wiele lat.

Streszczenie

Jest to metoda kriokonserwacji plemników ryb danio-ostropłetwych, stanowiąca adaptację metody Harveya (Harvey et al., 1982). Wprowadziliśmy dwie zmiany w oryginalnym protokole, które usprawniają procedurę i zwiększają jednorodność próbek. Po pierwsze, normalizujemy wszystkie objętości nasienia przy użyciu medium do mrożenia niezawierającego krioprotektanta. Po drugie, kriokonserwowane plemniki są przechowywane w krioprowetkach zamiast w kapilarach. Szybkość zamrażania i rozmrażania plemników (δ°C/czas) to prawdopodobnie dwie najważniejsze zmienne, które należy kontrolować w tej procedurze. Z tego powodu nie należy zastępować określonych probówek innymi. Pracując w dwuosobowych zespołach, możliwe jest zamrożenie nasienia 100 samców na zespół w czasie ok. 2 godzin. Plemniki kriokonserwowane zgodnie z tym protokołem wykazują średnią płodność na poziomie 25% (mierzoną jako liczba żywotnych embrionów uzyskanych w wyniku zapłodnienia in vitro podzielona przez całkowitą liczbę zapłodnionych jaj), a odsetek ten pozostaje stabilny przez wiele lat.

Protokół

Część A: Roztwory do mrożenia plemników

1. Roztwór Ringera dla ryb wg Ginsberga (przygotowywać na świeżo co 3 dni; Ginsburg, 1963)

UWAGA: KOLEJNOŚĆ DODAWANIA JEST ISTOTNA, ABY ZAPOBIECĆ WYTRĄCANIU OSIADU

W 450 ml sterylnej ddH2O rozpuścić:

• NaCl 3.25 g
• KCl 0.125 g
• CaCl2•2 H2O 0.175 g
  Następnie dodać:
• NaHCO3 0.10 g

Uzupełnić objętość końcową do 500 ml za pomocą sterylnej ddH2O i przechowywać w temperaturze 4°C.

2. Pożywka do zamrażania (Przygotowywać codziennie)

1. BEZ metanolu
   • roztwór Ginsburg Fish Ringers 10 ml (temp. pokojowa)
   • odtłuszczone mleko w proszku 1,5 gm
2. Z metanolem
   
   UWAGA: KOLEJNOŚĆ DODAWANIA JEST KLUCZOWA, ABY ZAPOBIEC NAC WYTRĄCANIU SIĘ OSADU
   
   
   • roztwór Ginsburg Fish Ringers 9 ml (temp. pokojowa)
   • metanol 1 ml
   • odtłuszczone mleko w proszku 1,5 g
   
   Po przygotowaniu medium do mrożenia mieszać dokładnie przez 20 min. na wytrząsarce orbitalnej lub kołysce. Przed użyciem rozdzielić do probótek eppendorf 1 ml, unikając powstawania pęcherzyków powietrza na powierzchni.
   

Część B: Materiały niezbędne do mrożenia plemników

Materiały niezbędne do mrożenia plemników

1. Jednorazowe pipety 10 μl (Fisherbrand kat# 22-358697)
2. Zlewki 250ml na wodę dla ryb zawierającą MESAB/Tricaine
3. Szkiełka zegarkowe (Pyrex kat# 9985-75)
4. Pipeta P20 Pipetman (lub równoważna) oraz końcówki
5. Gąbkowy uchwyt dla ryb (do unieruchomienia samca podczas wyciskania)
6. Mikroskop stereoskopowy z oświetleniem nadstołowym
7. Pinceta płaska (np. typu Millipore)
8. Probówki kriogeniczne 2.0ml (Corning kat# 430488)
9. Kriopudełka 10X10 (Nalgene kat#03-337-7AA)
10. Styropianowy pojemnik wypełniony ~ 15 cm drobno kruszonego suchego lodu1
11. Probówki stożkowe 15 ml (Falcon # 352099)
12. Naczynie Dewara z ciekłym azotem
13. Długie kleszcze (np. CMS Fisher Health Care kat# 10-316B)
14. Rękawice kriogeniczne
15. Zbiornik regeneracyjny dla samców
16. Jedna probówka Eppendorf wypełniona medium do mrożenia bez metanolu
17. Jedna probówka Eppendorf wypełniona medium do mrożenia z metanolem
18. Zamrażarka kriogeniczna (np. Taylor-Warton seria K)

¹ Prosta metoda przygotowania drobno zmielonego suchego lodu polega na zawinięciu go w ręcznik i rozkruszeniu młotkiem. Bardziej wydajną metodą jest zastosowanie młynka do suchego lodu, np. Clawson model RE-2.

Część C: Metoda zamrażania plemników

1. OZNACZANIE KAPILAR: Przed rozpoczęciem procedury należy oznaczyć kapilary 10μl pisakiem laboratoryjnym na poziomie 3,33 μl (tj. 16,7 mm od dołu; patrz Rys. 1.1).
2. ZESPOLENIE SAMCA: Umieścić samca/samców w zlewce zawierającej MESAB/tricainę rozcieńczoną w wodzie dla ryb (przepis w „The Zebrafish Book”).
3. OSUSZANIE RYBY: Po znieczuleniu wyjąć rybę z roztworu anestetyka za pomocą plastikowej łyżki i delikatnie osuszyć ją ręcznikiem papierowym, zwracając szczególną uwagę na osuszenie strony brzusznej. Woda aktywuje plemniki, dlatego ważne jest dokładne osuszenie okolic ujścia kloaki. Umieścić rybę na uchwycie gąbkowym stroną brzuszną do góry (Rys. 1.2). Jeśli obszar wokół płetwy odbytniczej jest nadal wilgotny, delikatnie osuszyć go chusteczką typu Kimwipe. Należy uważać, aby nie doprowadzić do przedwczesnego wydzielenia nasienia!
4. Umieścić oznaczoną kapilarę w gumowym adapterze do pipety ustnej, który jest dołączony do kapilar. Adapter stanowi gumowy wąż z ustnikiem na jednym końcu i uchwytem na kapilarę na drugim. Alternatywnie kapilarę można połączyć ze strzykawką Hamiltona 50μl za pomocą krótkiego odcinka rurki Tygon o odpowiedniej średnicy.
5. Umieścić samca pod mikroskopem i odsłonić otwór urogenitalny, ostrożnie rozsuwając płetwy brzuszne końcem kapilary.
6. POBIERANIE NASIENIA: Wywołać wydzielenie nasienia, delikatnie przesuwając gładkimi pincetami (np. Millipore) po bokach ryby lub delikatnie ściskając boki ryby między palcem wskazującym a kciukiem. Pobierać nasienie do kapilary w momencie jego wydzielania, stosując delikatne ssanie (Rys. 1.2). Należy unikać pobrania odchodów, które mogą zostać wydzielone wraz z nasieniem.
7. NORMALIZACJA OBJĘTOŚCI NASIENIA DO 3,3 μl: Jeśli objętość nasienia osiągnie lub przekroczy oznaczenie pisakiem na kapilarze (tj. 16,7 mm lub więcej), przejść do kroku 8. Jeśli objętość nasienia nie osiągnęła wartości docelowej, należy znormalizować objętość do oznaczenia, używając Medium do Zamrażania BEZ Metanolu (Rys. 1.3). Minimalna akceptowalna ilość nasienia zależy od jego jakości. Dobre nasienie jest białe i nieprzezroczyste. Nasienie słabej jakości ma wodnisty wygląd. Generalnie przyjmujemy następujące minima: 1 μl dobrego nasienia (lub 1/3 wartości docelowej) oraz 2 μl nasienia słabej jakości (lub 2/3 wartości docelowej). Objętość jest teraz znormalizowana do 3,3 μl.
8. DODANIE KRJOPROTEKTA: Naciągnąć Medium do Zamrażania Z Metanolem do pomarańczowego znacznika (całkowita objętość wynosi teraz ok. 20 μl; Rys. 1.4). Wypuścić mieszaninę nasienia i krioprotektanta na czystą powierzchnię szkła zegarowego, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół ok. 4 razy (unikając wprowadzania pęcherzyków).
9. PRZENIESIENIE 10μl NASIENIA DO KAŻDEJ Z 2 KRJOPROBEK: Nabrać 10 μl roztworu nasienie:krioprotektant i nanieść na dno dwóch osobnych, odpowiednio oznakowanych krioprobek (Rys. 1.5). Szybko zakręcić probówki i wrzucić je na dno probótek Falcon 15 ml o temperaturze pokojowej — jedna krioprobka na każdą probówkę Falcon. Zakręcić probówkę Falcon i umieścić parę probótek Falcon zawierających krioprobki w kruszonym suchym lodzie.
10. ZAMRAŻANIE NASIENIA PRZEZ 20 MIN. W SUCHYM LODZIE: Suchy lód powinien być w formie drobnego proszku, nie w granulach. Probówki należy zanurzyć w suchym lodzie na tyle głęboko, aby wystawały z niego jedynie ich zakrętki (Rys. 1.6). Aby monitorować probówki w suchym lodzie, należy nadać każdej parze probówek Falcon numer od 1 do 20 (zapisać na zakrętkach) i odnotować czas ich umieszczenia w suchym lodzie.
11. UMIEZCZENIE KRJOPROBEK W CIEKŁYM AZOCIE: Po zamrożeniu nasienia w suchym lodzie przez 20 min., przenieść je do naczynia Dewar z ciekłym azotem. Nasienie jest tu przechowywane do czasu umieszczenia w zamrażarce do azotu ciekłego. Podczas przenoszenia do pudełek zamrażarki, należy umieścić pudełko w kąpieli z ciekłego azotu, aby próbki się nie nagrzały. Do wyjmowania probówek z naczynia Dewar należy używać długich metalowych kleszczy i pracować w rękawicach kriogenicznych. Alternatywnie krioprobki można przenosić bezpośrednio z suchego lodu do pudełka zamrażarki, jeśli pudełko jest zanurzone w ciekłym azocie w pojemniku styropianowym.
12. Długoterminowo przechowywać krioprobki w kriogenicznej zamrażarce z ciekłym azotem. Aby zachować żywotność nasienia, ważne jest, aby probówki były przechowywane w pełnym zanurzeniu w ciekłym azocie. Z naszego doświadczenia wynika, że probówki przechowywane w fazie gazowej z czasem tracą żywotność.
    Szybkość działania jest kluczowa! Czas między dodaniem krioprotektanta a umieszczeniem probówek z nasieniem w suchym lodzie (tj. kroki 6-10) nie powinien przekroczyć 30 s.
    

Część D: Metoda zapłodnienia in vitro z wykorzystaniem kriokonserwowanych plemników

Stwierdzamy, że metoda ta działa najlepiej przy udziale dwóch osób. Jedna osoba wyciska komórki jajowe od samic, podczas gdy druga rozmraża plemniki.

1. Ustaw kąpiel wodną na 33°C.
2. Wyjmij krioprobowkę z zamrażarki z ciekłym azotem i przenieś ją do naczynia Dewar z ciekłym azotem do momentu rozpoczęcia rozmrażania.
3. Wyciskaj jaja z samic do plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm. Jeśli to możliwe, spróbuj uzyskać 3 nieśmiertelne zbiory jaj i połącz je w jednej szalce. Jeśli nie uda się uzyskać trzech dobrych zbiorów w ciągu 1 min od pierwszego zbioru, przejdź do kroku 4 (jeden dobry zbiór jest wystarczający). Definicja dobrego zbioru: >150 jednolitych, dobrze wyglądających jaj (tj. żółtawych, bez białych zanieczyszczeń świadczących o degradacji). Przykryj szalkę podczas rozmrażania plemników.
4. Wyjmij probówkę z ciekłego azotu i zdejmij korek. Szybko zanurz probówkę mniej więcej do 1/2 wysokości w kąpieli wodnej o temperaturze 33°C na 8-10 s.
5. Szybko dodaj do probówki 70 μl roztworu Hanksa o temperaturze pokojowej i wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół. Natychmiast dodaj do jaj i delikatnie wymieszaj końcówką pipety.
6. Bezzwłocznie aktywuj plemniki i jaja, dodając 750 μl wody dla ryb. Zamieszaj przez wirowanie. Inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej.
7. Po 5 min napełnij szalkę wodą dla ryb i inkubuj ją w temperaturze 28°C. Po 2-3 h policz i przenieś zapłodnione embriony do szalek o średnicy 100 mm (po 50 na szalkę). Policz niezapłodnione jaja, aby móc określić częstotliwość zapłodnienia.
8. Odpowiednio pielęgnuj larwy! Przez pierwsze 5 dni codziennie wymieniaj wodę i usuwaj martwe embriony. Przenieś do przedszkola w 5. dniu tylko te larwy, które posiadają pęcherz pławny.

Część E: Reprezentatywne wyniki

Wykorzystaliśmy tę metodologię kriozachowania do stworzenia biblioteki 8600 zamrożonych próbek nasienia do TILLING w latach 2001–2003. Rozmroziliśmy 106 z tych próbek i określiliśmy ich płodność. Płodność jest stosunkiem żywotnych zarodków powstałych w procesie zapłodnienia in vitro do całkowitej liczby jaj zapłodnionych zamrożonym nasieniem. Świeże (niekriokonserwowane) nasienie wykazuje zazwyczaj płodność >95%; nasienie kriokonserwowane ma znacznie niższą płodność: średnio 29% (n=106 fiolek). Zmienność płodności między poszczególnymi fiolkami jest duża i wynosi od mniej niż 1% do nawet 62%. Zmienność ta jest przedstawiona na Rys. 2 za pomocą dużych słupków błędów oznaczających odchylenie standardowe. Jednakże w 106 próbkach nasienia rozmrożonych do tej pory tylko raz odnotowano 0% płodności w obu próbkach nasienia, co uniemożliwiło odzyskanie odpowiadającej im mutacji TILLING.

Odmrażając fiolki z nasieniem z naszej biblioteki na przestrzeni kilku lat (2001-2008), ustaliliśmy, że średnia płodność próbek nasienia zamrożonych tą metodą pozostaje stabilna w czasie (Rys. 2). Średnia płodność zamrożonych próbek nasienia rozmrożonych w 2001 roku wynosiła 23,5% (na podstawie 11 próbek nasienia), a w 2008 roku wynosiła 25% (na podstawie 21 próbek nasienia).

Liczni inni badacze stosują obecnie ten protokół mrożenia plemników w swoich laboratoriach. Niektórzy zgłaszali sukcesy w zakresie wskaźników płodności oraz zmienności między próbkami, zbliżone do naszych obserwacji. Inni natomiast donieśli o niepowodzeniu w implementacji tego protokołu w swoich warunkach. Uważamy, że prawdopodobnymi źródłami problemów są:

1. Niestosowanie dokładnie tych samych krioprowetek lub probówek stożkowych, które zasugerowano w protokole, co prowadzi do innej szybkości chłodzenia w suchym lodzie;
2. Niestosowanie sypkiego suchego lodu, co prowadzi do nieoptymalnej szybkości chłodzenia;
3. Użycie samców o niskiej płodności: z jednego samca powinno uzyskać się co najmniej 1 μl nasienia. Można również sprawdzić płodność samców, wykonując zapłodnienie in vitro ze świeżym nasieniem, jednak może to być mylące, ponieważ do uzyskania blisko 100% zapłodnienia potrzeba bardzo niewielkiej ilości świeżego nasienia.
4. Użycie jaj o niskiej jakości podczas zapłodnienia in vitro. Użycie jakichikolwiek partii jaj innych niż idealne zawsze prowadzi do blisko 0% zapłodnienia, nawet w przypadku próbek nasienia, które w rzeczywistości wykazują dobrą płodność (na podstawie płodności probówki powtórzonej).

Rycina 1. Schemat metodologii mrożenia plemników.

Rysunek 2. Płodność kriosprzedzamrożonych plemników pozostaje stabilna w czasie. Procent płodności to liczba żywotnych zarodków uzyskanych podczas zapłodnienia in vitro podzielona przez całkowitą liczbę jaj zapłodnionych zamrożonymi plemnikami. „n” oznacza liczbę fiolek z kriosprzedzamrożonymi plemnikami, których płodność była badana w odpowiednim roku. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Ponieważ każda fiolka z plemnikami pochodzi od innego samca, obserwuje się zmienność między fiolkami.

Dyskusja

Liczni inni badacze stosują obecnie ten protokół mrożenia plemników w swoich laboratoriach. Niektórzy zgłosili podobną płodność oraz taką samą zmienność między próbkami, jaką zaobserwowaliśmy. Inni rzekomo nie zdołali wprowadzić tego protokołu w życie we własnych pracowniach. Uważamy, że prawdopodobnymi źródłami problemów są:

1. Niestosowanie dokładnie tych samych krioproletek lub probówek stożkowych, które sugerujemy w protokole, co prowadzi do innej szybkości chłodzenia w suchym lodzie;
2. Niestosowanie sproszkowanego suchego lodu, co prowadzi do nieoptymalnej szybkości chłodzenia;
3. Użycie samców o niskiej płodności: z jednego samca należy uzyskać co najmniej 1 μl nasienia. Płodność samców można również testować, przeprowadzając zapłodnienie in vitro ze świeżym nasieniem, jednak może to być mylące, ponieważ do uzyskania blisko 100% płodności wystarczy niewielka ilość świeżego nasienia. Większe samce o bardziej intensywnym ubarwieniu zazwyczaj dostarczają więcej nasienia wyższej jakości.
4. Użycie jaj o niskiej jakości podczas zapłodnienia in vitro. Wykorzystanie jakichkolwiek partii jaj innych niż idealne zawsze prowadzi do blisko 0% płodności, nawet w przypadku próbek nasienia, które w rzeczywistości wykazują dobrą płodność (na podstawie płodności probówki powtórzonej).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 μjednorazowe pipety	Fisher Scientific	22-358697
Szkiełka zegarkowe	Pyrex	9985-75
probówki kriogeniczne 2 ml	Corning	430488
kriopudełka 10 x 10	Nalge Nunc international	03-337-7AA
probówki stożkowe 15 ml	Falcon BD	352099
Kleszcze	Fisher Scientific	10-316B
Zamrażarka niskotemperaturowa	Taylor-Wharton	seria K	Na przykład