Wysokoprzepustowa metoda kriokonserwacji nasienia danio pręgowanego i zapłodnienia in vitro

Podsumowanie

To jest protokół kriokonserwacji nasienia o wysokiej przepustowości dla danio pręgowanego. Kriokonserwacja nasienia przy użyciu tego protokołu ma średnio 25% płodności w późniejszym zapłodnieniu in vitro i jest stabilna przez wiele lat.

Streszczenie

Jest to metoda kriokonserwacji nasienia danio pręgowanego, która jest adaptacją metody Harveya (Harvey i wsp., 1982). Wprowadziliśmy dwie zmiany do pierwotnego protokołu, które zarówno usprawniają procedurę, jak i zwiększają jednorodność próbki. Po pierwsze, normalizujemy wszystkie objętości plemników za pomocą pożywki do zamrażania, która nie zawiera krioprotektantu. Po drugie, kriokonserwowane plemniki są przechowywane w kriowialiach zamiast w rurkach kapilarnych. Szybkość zamrażania i rozmrażania plemników (δ°C/czas) to prawdopodobnie dwie najbardziej krytyczne zmienne, które należy kontrolować w tej procedurze. Z tego powodu nie należy zastępować określonych rurek innymi rurkami. Pracując w zespołach 2-osobowych, możliwe jest zamrożenie nasienia 100 samców w zespole w ciągu ~2 godzin. Kriokonserwacja nasienia przy użyciu tego protokołu ma średnio 25% płodność (mierzoną jako liczba zdolnych do życia zarodków powstałych w wyniku zapłodnienia in vitro podzielona przez całkowitą liczbę zapłodnionych komórek jajowych) i ten procent płodności jest stabilny przez wiele lat.

Protokół

Część A: Roztwory do zamrażania nasienia

1. Żeń-berskie Dzwonki Rybne (Świeże co 3 dni; Ginsburg, 1963)

UWAGA: KOLEJNOŚĆ DODAWANIA JEST WAŻNA, ABY ZAPOBIEC OPADOM ATMOSFERYCZNYM.

W 450 ml sterylnego ddH2O rozpuścić:

• NaCl 3,25 g
• KCl 0,125 g
• CaCl2•2 H2O 0,175 g
  Następnie dodaj:
• NaHCO3 0,10 gr

Doprowadzić końcową objętość do 500 ml za pomocą sterylnego ddH2O i przechowywać w temperaturze 4°C.

2. Zamrażanie Medium (Codziennie Rób świeże)

1. BEZ METANOLU
   • Ginsburg Fish Ringers 10 ml (temp. pokojowa)
   • Mleko odtłuszczone w proszku 1,5 g
2. Z Metanolem
   
   UWAGA: KOLEJNOŚĆ DODAWANIA JEST WAŻNA, ABY ZAPOBIEC WYTRĄCANIU
   
   
   • Ginsburg Fish Ringers 9 ml (temp. pokojowa)
   • Metanol 1 ml
   • Mleko odtłuszczone w proszku 1,5 g
   
   Po złożeniu pożywki do zamrażania, dobrze mieszaj przez 20 minut na wytrząsarce orbitalnej lub kołysce. Przed użyciem rozlać porcję na 1 ml probówek eppendorf, unikając pęcherzyków na powierzchni.
   

Część B: Materiały potrzebne do zamrażania nasienia

Materiały potrzebne do zamrożenia nasienia

1. Pipety jednorazowe 10 μl (Fisherbrand kat# 22-358697)
2. Zlewki o pojemności 250 ml do wody rybnej zawierającej MESAB/Trikaine
3. okulary do zegarków (Pyrex cat# 9985-75)
4. Pikietman P20 (lub odpowiednik) i końcówki
5. Uchwyt na rybę z gąbki (do trzymania samca podczas ściskania)
6. Mikroskop preparacyjny z oświetleniem scenicznym
7. Kleszcze płaskie (np. Typ milipore)
8. 2,0 ml fiolki kriogeniczne (Corning cat# 430488)
9. Krioboxy 10X10 (kot Nalgene#03-337-7AA)
10. Pojemnik styropianowy wypełniony ~ 15 cm drobno pokruszonego suchego lodu1
11. Probówki stożkowe 15 ml (Falcon # 352099)
12. Kolba Dewara zawierająca ciekły azot
13. Szczypce długie (np. CMS Fisher Health Care kat# 10-316B)
14. Rękawice kriogeniczne
15. Zbiornik rekuperacyjny dla mężczyzn
16. Jedna probówka eppendorfa wypełniona środkiem zamrażającym bez metanolu
17. Jedna probówka eppendorfa wypełniona środkiem zamrażającym z metanolem
18. Kriozamrażarka (np. Taylor-Warton K-series)

¹ Prostą metodą na zrobienie drobno pokruszonego suchego lodu jest zawinięcie go w ręcznik i sproszkowanie młotkiem. Bardziej wydajną metodą jest użycie młynka do suchego lodu, np. Clawson model RE-2.

Część C: Metoda zamrażania nasienia

1. ZAZNACZ RURKI KAPILARNE: Przed rozpoczęciem należy oznaczyć rurki kapilarne 10 μl pisakiem laboratoryjnym na poziomie 3.33 μl (tj. 16.7 mm od dołu; patrz rys. 1.1).
2. ZNIECZULENIE SAMCA: Umieść samca (samców) w zlewce zawierającej MESAB/trikainę rozcieńczoną w wodzie dla ryb (przepis w "Księdze danio pręgowanego")
3. SUCHA RYBA: Po znieczuleniu wyjmij rybę ze znieczulenia za pomocą plastikowej łyżki i delikatnie osusz rybę na ręczniku papierowym, zwracając szczególną uwagę na osuszenie strony brzusznej. Woda aktywuje plemniki, dlatego ważne jest, aby dokładnie wysuszyć okolice kloaki. Umieść rybę na uchwycie gąbki, brzusznie do góry (rys. 1.2). Jeśli obszar wokół płetwy odbytowej jest nadal wilgotny, delikatnie osusz go chusteczką kimwipe. Uważaj, aby nie wycisnąć przedwcześnie nasienia!
4. Umieść oznaczoną rurkę kapilarną w gumowym adapterze do pipet doustnych, który jest dołączony do rurek kapilarnych. Adapter to gumowy wąż, który ma ustnik na jednym końcu i uchwyt kapilarny na drugim. Alternatywnie, rurkę kapilarną można podłączyć do strzykawki Hamilton o pojemności 50 μl za pomocą krótkiego odcinka rurki tygon o odpowiedniej średnicy.
5. Umieść mężczyznę pod lunetą i odsłoń otwór moczowo-płciowy, ostrożnie rozsuwając płetwy brzuszne za pomocą końca rurki kapilarnej.
6. ZBIERAJ NASIENIE: Wydal plemniki, delikatnie głaszcząc boki ryby gładkimi kleszczami (np. Millipore) lub delikatnie ściskając boki ryby między palcem wskazującym a kciukiem. Zbierz plemniki w rurki kapilarnej, gdy są wydalane za pomocą delikatnego ssania (ryc. 1.2). Unikaj kału, który może zostać wydalony wraz z plemnikami.
7. NORMALIZUJ OBJĘTOŚĆ PLEMNIKÓW DO 3,3 μl: Jeśli objętość plemników osiąga lub przekracza ślad pisaka na rurki kapilarnej (tj. 16,7 mm lub więcej), przejdź do kroku 8. Jeśli objętość plemników nie osiągnie objętości docelowej, znormalizuj objętość do śladu po długopisie za pomocą pożywki do zamrażania BEZ metanolu (ryc. 1.3). Minimalna akceptowalna ilość plemników różni się w zależności od jakości nasienia. Dobre plemniki są białe i nieprzezroczyste. Słaba sperma wygląda na wodnistą. Ogólnie rzecz biorąc, za minimum przyjmujemy: 1 μl dobrego plemnika (lub 1/3 celu) i 2 μl słabego plemnika (lub 2/3 celu). Objętość jest teraz znormalizowana do 3,3 μl.
8. DODAJ KRIOPROTEKTANT DO NASIENIA: Zassaj pożywkę do zamrażania z metanolem do pomarańczowego znaku (ok. całkowita objętość wynosi teraz 20 μl; Rys. 1.4). Wylej mieszaninę nasienia i krioprotekcji na czystą powierzchnię szkiełka zegarka, zwracając szczególną uwagę, aby nie wprowadzać pęcherzyków. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół ~ 4 razy (unikać wprowadzania bąbelków).
9. UMIEŚĆ 10 ΜL PLEMNIKÓW W KAŻDYM Z 2 KOŚCI: Odpipetuj 10 μl roztworu nasienia: krioprotektantu na dnie dwóch oddzielnych kriowali, które zostały oznaczone odpowiednimi informacjami (ryc. 1.5). Poruszając się szybko, zakręć fiolki i wrzuć je na dno 15 ml probówek Falcon o temperaturze pokojowej - jedna kriowialna / probówka. Zakryj probówkę Falcon i włóż parę probówek Falcon zawierających kriowial do pokruszonego suchego lodu.
10. ZAMRAŻAJ PLEMNIKI PRZEZ 20 MINUT NA SUCHYM LODZIE: Suchy lód powinien być w postaci drobnego proszku, a nie granulek. Rurki należy włożyć do suchego lodu na tyle głęboko, aby były widoczne tylko ich nakrętki (rys. 1.6). Aby śledzić probówki w suchym lodzie, nadaj każdej parze rurek Falcon liczbę od 1 do 20 (napisaną na nakrętkach) i zapisz czas, w którym wchodzą do suchego lodu.
11. UMIEŚĆ KRIOWIALE W CIEKŁYM AZOCIE: Po zamrożeniu plemników na suchym lodzie przez 20 minut, przenieś je do kolby dewara zawierającej ciekły azot. Nasienie jest tutaj przechowywane do czasu umieszczenia w zamrażarce z ciekłym azotem. Umieszczając je w zamrażarkach, należy je umieścić w kąpieli z ciekłym azotem, aby próbki nie nagrzewały się. Użyj długich metalowych szczypiec, aby odzyskać fiolki z kolby Dewara i obchodź się z kriorękawicami. Alternatywnie, kriowiale można przenieść bezpośrednio z suchego lodu do zamrażarki, jeśli zamrażarka jest zanurzona w ciekłym azocie w pojemniku styropianowym.
12. Przechowuj kriowiale przez długi czas w kriogenicznej zamrażarce z ciekłym azotem. Aby utrzymać żywotność plemników, ważne jest, aby fiolki były przechowywane zanurzone w ciekłym azocie. Z naszego doświadczenia wynika, że fiolki przechowywane w fazie gazowej z czasem tracą żywotność.
    Szybkość jest ważna! Czas między dodaniem krioprotektantu a umieszczeniem fiolek z nasieniem w suchym lodzie (tj. kroki 6-10) nie powinien przekraczać 30 sekund.
    

Część D: Metoda zapłodnienia in vitro z wykorzystaniem kriokonserwowanych plemników

Uważamy, że to działa najlepiej w przypadku dwóch osób. Jedna osoba wyciska jaja od samic, podczas gdy druga osoba rozmraża plemniki.

1. Ustawić łaźnię wodną na 33°C.
2. Wyjmij kriowial z zamrażarki z ciekłym azotem i przenieś do kolby Dewara zawierającej ciekły azot, aż będzie gotowy do rozmrożenia.
3. Wyciśnij jaja samic do plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm. Jeśli to możliwe, postaraj się zdobyć 3 lęgi jajek i połączyć w jedno naczynie. Jeśli nie możesz uzyskać trzech dobrych sprzęgieł w ciągu 1 minuty od pierwszego sprzęgła, przejdź do kroku 4 (wystarczy jedno dobre sprzęgło). Definicja dobrego sprzęgła: >150 jednolicie ładnie wyglądających jaj (tj. żółtawych, bez białych śmieci wskazujących na degradację). Trzymaj naczynie pod przykryciem, gdy plemniki są rozmrażane.
4. Wyjąć fiolkę z ciekłego azotu i zdjąć nakrętkę. Szybko zanurz fiolkę ~1/2 drogi w łaźni wodnej o temperaturze 33°C na 8-10 sekund.
5. Szybko dodaj 70 μl Hanksa o temperaturze pokojowej do fiolki i wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Natychmiast dodaj do jajek i delikatnie wymieszaj końcówką pipety.
6. Niezwłocznie aktywuj plemniki i jaja, dodając 750 μl wody dla ryb. Zamieszaj, aby wymieszać. Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Po 5 minutach napełnij naczynie wodą rybną i inkubuj naczynie w temperaturze 28°C. Po 2-3 godzinach policz i przenieś płodne zarodki na szalki o średnicy 100 mm (50 na talerz). Policz niepłodne jaja, aby można było określić częstotliwość zapłodnienia.
8. Dbaj o larwy! Przez pierwsze 5 dni codziennie zmieniaj wodę i usuwaj martwe zarodki. Umieść tylko larwy, które mają pęcherze pławne, do żłobka w 5 dniu.

Część E: Reprezentatywne wyniki

Użyliśmy tej metodologii crypreservation do stworzenia biblioteki 8600 próbek zamrożonych plemników do TILLING w latach 2001-2003. Rozmroziliśmy 106 z tych próbek i określiliśmy ich płodność. Płodność to stosunek zdolnych do życia zarodków wytworzonych w procesie zapłodnienia in vitro podzielony przez całkowitą liczbę komórek jajowych, które zostały zapłodnione zamrożonymi plemnikami. Świeże (niekrypokonserwowane) plemniki mają zazwyczaj >95% płodności; Kriokonserwowane plemniki mają znacznie niższą płodność: średnio 29% (n=106 fiolek). Zmienność płodności między fiolkami jest duża i waha się od mniej niż 1% do nawet 62%. Zmienność ta jest reprezentowana przez duże słupki błędów reprezentujące odchylenie standardowe na rys. 2. Jednak w 106 próbkach nasienia, które zostały rozmrożone do tej pory, tylko raz doświadczyliśmy 0% płodności w obu próbkach nasienia i nie udało nam się odzyskać odpowiadającej im mutacji TILLING.

Poprzez rozmrażanie fiolek z nasieniem z naszej biblioteki przez kilka lat (2001-2008) odkryliśmy, że średnia płodność próbek nasienia zamrożonych tą metodą pozostaje stabilna w czasie (Ryc. 2). Średnia płodność zamrożonych próbek nasienia rozmrożonych w 2001 r. wynosiła 23,5% (na podstawie 11 próbek nasienia), a w 2008 r. 25% (na podstawie 21 próbek nasienia).

Wielu innych badaczy korzysta teraz z tego protokołu zamrażania nasienia w swoich laboratoriach. Niektóre z nich odnotowały dobre wyniki w zakresie wskaźników płodności i zmienności między próbami podobnymi do tych, które zaobserwowaliśmy. Inni podobno nie zdołali sprawić, by ten protokół działał w ich rękach. Uważamy, że prawdopodobnymi źródłami problemów są:

1. Niestosowanie dokładnych kriowiali lub stożkowych rurek, które zasugerowaliśmy w protokole, co prowadzi do innego tempa chłodzenia w suchym lodzie;
2. Niestosowanie sproszkowanego suchego lodu, co prowadzi do nieoptymalnego tempa chłodzenia;
3. Używanie samców ryb o słabej płodności: powinieneś uzyskać co najmniej 1 μl nasienia od jednego samca. Możesz również przetestować męską płodność, wykonując zapłodnienie in vitro świeżym plemnikiem, jednak może to być mylące, ponieważ potrzeba bardzo mało świeżych plemników, aby zbliżyć się do 100% płodności.
4. Używanie komórek jajowych niskiej jakości w zapłodnieniu in vitro. Używanie czegokolwiek innego niż idealne sprzęgła zawsze prowadzi do prawie 0% płodności, nawet w przypadku próbek nasienia, które faktycznie mają dobrą płodność (w oparciu o płodność duplikatu fiolki).

Rysunek 1. Schemat metodyki zamrażania nasienia.

Rysunek 2. Kriokonserwowana płodność plemników pozostaje stabilna w czasie. Procent płodności to liczba zdolnych do życia zarodków wytworzonych w procesie zapłodnienia in vitro podzielona przez całkowitą liczbę komórek jajowych, które zostały zapłodnione zamrożonymi plemnikami. "N" odnosi się do liczby fiolek z plemnikami w kriokonserwacji, których płodność została przebadana w danym roku. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Ponieważ każda fiolka z plemnikami pochodzi od innego samca, obserwuje się zmienność między fiolkami.

Dyskusja

Wielu innych badaczy stosuje teraz ten protokół zamrażania nasienia w swoich laboratoriach. Niektóre zgłaszały podobną płodność i tę samą zmienność między próbami, którą zaobserwowaliśmy. Inni podobno nie zdołali sprawić, by ten protokół działał w ich rękach. Uważamy, że prawdopodobnymi źródłami problemów są:

1. Niestosowanie dokładnych kriowiali lub stożkowych rurek, które zasugerowaliśmy w protokole, co prowadzi do innego tempa chłodzenia w suchym lodzie;
2. Niestosowanie sproszkowanego suchego lodu, co prowadzi do nieoptymalnego tempa chłodzenia;
3. Używanie samców ryb o słabej płodności: powinieneś uzyskać co najmniej 1 μl nasienia od jednego samca. Możesz również przetestować męską płodność, wykonując zapłodnienie in vitro świeżym plemnikiem, jednak może to być mylące, ponieważ potrzeba bardzo mało świeżych plemników, aby zbliżyć się do 100% płodności. Więksi, bardziej mocno ubarwieni mężczyźni zazwyczaj dają więcej plemników o wyższej jakości.
4. Używanie komórek jajowych niskiej jakości w zapłodnieniu in vitro. Używanie czegokolwiek innego niż idealne sprzęgła zawsze prowadzi do prawie 0% płodności, nawet w przypadku próbek nasienia, które faktycznie mają dobrą płodność (w oparciu o płodność duplikatu fiolki).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 μ l pipety jednorazowe	Fisher Scientific	22-358697
Okulary do zegarków	Pyrex	9985-75
Fiolki kriogeniczne 2 ml	Corning	430488
10 x 10 krioboxów	Nalge Nunc international	03-337-7AA
15 ml probówki stożkowe	Falcon BD	352099
Szczypce	Fisher Scientific	10-316B
Kriozamrażarka	Taylor-Wharton	serii K:	na przykład