Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanych za pomocą wczesnego wywierania nacisku

13.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1396

⸱

30 czerwca 2009

 ,  , 
1Institute of Neuroscience, University of Oregon, 2Division of Basic Science, Fred Hutchinson Cancer Research Center - FHCRC

W tym artykule

Podsumowanie

Jest to metoda generowania gynogenetycznych diploidalnych embrionów danio przeżębnika (embrionów, których jedynym wkładem genetycznym jest materiał macierzysty), poprzez blokowanie drugiego podziału mejozy bezpośrednio po zapłodnieniu plemnikami inaktywowanymi światłem ultrafioletowym. Embriony EP nie są w pełni homozygotyczne ze względu na rekombinację podczas pierwszego podziału mejozy, są jednak homozygotyczne we wszystkich loci, które nie zostały oddzielone od centromeru w wyniku rekombinacji.

Streszczenie

Heterozygotyczność u diploidalnych eukariontów często utrudnia badania genetyczne. Metody pozwalające na uzyskanie żywotnych potomstwa diploidalnego, homozygotycznego bezpośrednio od samic heterozygotycznych umożliwiają bezpośredni przesiew samic F1 poddanych mutagenezie w celu wykrycia mutacji szkodliwych w przyspieszonym ekranie genetycznym typu forward. Streisinger et al.1,2opisano metody otrzymywania gynogenetycznych (homozygotycznych) diploidalnych danio pręgowanych poprzez aktywację jaj danio za pomocą nasienia inaktywowanego promieniowaniem ultrafioletowym oraz zapobieganie drugiej dywizji mejotycznej lub pierwszej dywizji komórkowej zygoty za pomocą zabiegów fizycznych (ciepła lub ciśnienia), które depolimeryzują mikrotubule. Metoda „wczesnego ciśnienia” (EP) blokuje mejozę II, która zachodzi krótko po zapłodnieniu. Metoda EP daje wysoki odsetek żywotnych embrionów, które mogą rozwinąć się w płodne dorosłe osobniki obu płci. Metoda ta generuje embriony homozygotyczne we wszystkich locus, z wyjątkiem tych, które zostały oddzielone od centromeru w wyniku rekombinacji podczas mejozy I. Homozygotyczne mutacje wykrywa się w kłakach EP w zakresie od 50% dla locus centromerowych do mniej niż 1% dla locus telomerowych. Metoda ta została odtworzona słowo w słowo z Zebrafish Book3.

Protokół

Przegląd wczesnego ciśnienia

Uwaga: receptury na wiele z odczynników stosowanych w tym protokole, takich jak tricaina, woda dla ryb oraz sól Hanksa, są dostępne online w rozdziale 10 książki The Zebrafish Book3 (http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html)

  1. Uzyskać embriony poprzez zapłodnienie in vitro z użyciem plemników inaktywowanych promieniami UV.
  2. Niezwłocznie przenieść zapłodnione jaja do szklanej fiolki (z plastikowym zamknięciem zatrzaskowym) wypełnionej po brzegi wodą dla jaj. Przykryć otwarty koniec fiolki cienką arkuszem gumy lateksowej i zatrzasnąć górną część (w której wycięto otwór) na fiolce, dociskając gumę.
  3. Umieścić fiolkę w prasie hydraulicznej i w 1,4 min po zapłodnieniu zwiększyć ciśnienie do 8,000 p.s.i. (Należy pamiętać, że wiele pras jest skalibrowanych tak, aby odczytywać ciśnienie wywierane na tłok o średnicy 2 cali, zatem odczyty muszą zostać przeliczone na p.s.i.)
  4. Zacząć stopniowo zwalniać ciśnienie w ciągu 1 min, począwszy od 6 min po zapłodnieniu.

Szczegółowa procedura wstępnego ciśnienia

  1. Dzień przed eksperymentem
    1. Późnym popołudniem oddziel samce i samice przeznaczone do wyciskania. Można użyć dowolnego starszego samca, ponieważ nie będzie on dostarczał materiału genetycznego. Samice powinny być duże i mieć wydęte brzuchy. Samce powinny mieć żółty kolor i być żwawe.
    2. Przechowuj samice i samce oddzielnie przez noc w zbiornikach, do których będzie można łatwo uzyskać dostęp rano.
  2. Dzień eksperymentu (rano)
    1. Przygotuj roztwór Hanksa; dodaj wodorowęglan sodu.
    2. Zabierz do rybochowli: wiadro z lodem, roztwór Hanksa, tricain, timer, probówki do zbierania nasienia.
    3. Rozcieńcz tricain w wodzie dla ryb.
  3. Zbiór nasienia
    1. Przygotuj przejrzystą fiolkę z roztworem Hanksa na lodzie. Odmierz ~50 μl na każdego samca przeznaczonego do wyciskania.
    2. Zanurz 3 lub 4 samce jednocześnie w tricainie w celu znieczulenia. Można je wyciągnąć z znieczulenia za pomocą plastikowej łyżki.
    3. Opłucz w wodzie dla ryb i osusz ręcznikiem papierowym do stanu „wilgotno-suchego” (bardzo ważne: woda aktywuje plemniki).
    4. Umieść rybę w uchwycie z pianki pod stereomikroskopem przy małym powiększeniu z oświetleniem episkopowym. Rozchyl płetwy brzuszne pęsetą i umieść mikrokapilarę przy ujściu kloaki.
    5. Gładkimi pęsetami (Millipore) delikatnie, ale stanowczo masuj boki ryby.
    6. Gdy mleczne nasienie zacznie wypływać z otworu kopulacyjnego, zbierz je do mikrokapilary za pomocą delikatnego zasysania.
    7. Połącz nasienie od kilku samców w lodowatym roztworze Hanksa. Nasienie od 5-10 samców jest wystarczające do zapłodnienia kilkuset jaj. Plemniki w zimnym roztworze Hanksa będą skutecznie zapładniać jaja przez kilka godzin, a nawet dni. Oceń „na oko” stężenie nasienia, zbierając ilość wystarczającą do uzyskania mętnej zawiesiny.
  4. Inaktywacja nasienia promieniami UV
    1. Wypełnij dno szklanej płytki Petriego lodem.
    2. Połóż szkiełko zegarkowe na lodzie w płytce.
    3. Za pomocą pipety Pasteura przenieś nasienie z probówki na szkiełko zegarkowe. Upewnij się, że do pipety pobrano jak najwięcej nasienia, nie wciągając pęcherzyków powietrza. Ponadto, nie napowietrzaj nasienia na szkiełku podczas jego wyprowadzania z pipety. Rozlej nasienie cienką, równą warstwą na szkiełku. WYRZUĆ TĘ PIPETĘ.
    4. Umieść płytkę Petriego w urządzeniu do sieciowania UV.
    5. Włącz urządzenie na 2 minuty.
    6. Używając CZYSTEJ pipety, zbierz nasienie ze szkiełka zegarkowego i przenieś je do probówki Eppendorf oznaczonej jako „Nasienie UV”, a następnie umieść na lodzie.
  5. Zbiór jaj i zapłodnienie in vitro
    1. Znieczul trzy lub cztery samice jednocześnie w tricainie.
    2. Opłucz w wodzie dla ryb i osusz "wilgotno-sucho" ręcznikiem papierowym. Nadmiar wody spowoduje pęcznienie jaj i uniemożliwi zapłodnienie.
    3. Umieść samicę w plastikowej płytce Petriego o średnicy 35 mm i wilgotnymi (nie mokrymi) palcami delikatnie, ale stanowczo naciśnij na brzuch. Jeśli samica jest gotowa do tarła, jaja wyjdą dość łatwo.
    4. Zbierz jaja szpatułką i zwróć samicę do wody. Dobre jaja mają żółtawy, półprzezroczysty kolor, natomiast jaja, które zbyt długo pozostały w samicy, są białe i wodniste (patrz poniżej). Aby mieć pewność uzyskania dobrych jaj, zbieraj je w ciągu pierwszych 2 godzin po zapaleniu świateł w rybochowli. Trzymaj jaja pod przykryciem, aby zapobiec ich wysychaniu.
    5. Dodaj 30-50 μl zawiesiny nasienia UV do jaj, wymieszaj delikatnie końcówką pipety.
    6. Natychmiast dodaj około 1 ml wody dla ryb i uruchom timer. Jaja pozostawione do rozwoju na tym etapie będą haploidalne.
  6. Wczesne ciśnienie. Uwaga: kroki a-g muszą zostać wykonane w ciągu 90 sekund od zapłodnienia!
    1. Uruchom timer w momencie aktywacji jaj poprzez dodanie wody.
    2. Odczekaj chwilę i dodaj więcej wody, zakręć jajami, aby skupiły się w centrum płytki.
    3. Używając uciętej i wypolerowanej pipety Pasteura, przenieś zapłodnione jaja do fiolek ciśnieniowych.
    4. Jeśli to konieczne, dodaj więcej wody z jajami do fiolek tak, aby były prawie przepełnione, pozostawiając kroplę wody na krawędzi fiolek.
    5. Nałóż gumową zatyczkę na kroplę wody i zabezpiecz plastikową pokrywką nad gumą.
    6. Umieść fiolkę(fiolki) do góry dnem w cylindrze ciśnieniowym, dolewając więcej wody z jajami, aby wypełnić cylinder. Mocno zakręć cylinder.
    7. Umieść cylinder w prasie z tłokiem skierowanym w górę i zastosuj nacisk 8,000 lbs/sq. in.
    8. Pozostaw cylinder w prasie do 6 min od czasu aktywacji (łącznie przez 4,5 min ciśnienia).
    9. W 6 minucie po aktywacji wyjmij cylinder z prasy, a następnie wyjmij fiolki z cylindra. Ostrożnie osusz fiolki, aby zapobiec ochłodzeniu embrionów.
    10. Zresetuj cylinder i ponownie napełnij go wodą z jajami.
    11. Przygotuj kolejne fiolki, wypełniając je częściowo wodą z jajami w razie potrzeby.
    12. Powtórz dla wszystkich partii jaj.

UWAGA: Cylinder pomieści jednocześnie do 3 fiolek, dlatego można opóźnić zapłodnienie jaj o kilka minut, aby sprawdzić, czy pozostałe samice znajdujące się już w tricainie złożą ikrę. Pozwoli to przyspieszyć pracę poprzez jednoczesne przetwarzanie większej liczby partii. Należy również pamiętać, że w momencie korzystania z prasy nie wolno umieszczać kolejnych ryb w tricainie, dopóki zabieg nie zostanie zakończony. Zbyt długie przebywanie ryb w środku anestetycznym może doprowadzić do ich śmierci. Ponadto, jeśli wyciśnie się ikrę z ryb podczas gdy prasa jest zajęta, jaja mogą stać się zbyt suche, by zachować żywotność do czasu ponownego zwolnienia urządzenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ważne jest upewnienie się, że embriony otrzymane tą metodą są prawdziwymi diploidami gynogenetycznymi. W ramach kontroli należy wyhodować partię normalnych jaj diploidalnych (odkładając część plemników bez inaktywacji UV) oraz partię embrionów haploidalnych (odkładając partię jaj zapłodnionych plemnikami poddanymi działaniu UV, ale bez przeprowadzenia procedury EP). W 1. dniu po zapłodnieniu embriony haploidalne charakteryzują się krótką osią ciała oraz nieregularną morfologią mózgu i somytów. Haploidy nie są żywotne po ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Metody zapłodnienia in vitro oraz otrzymywania diploidów gynogenetycznych dla danio pręgowanego zostały opracowane przez Charline Walker w laboratorium George'a Streisingera na Uniwersytecie Oregon w latach 70. i 80. XX wieku. Opisana tutaj metoda nie różni się od protokołów Charline, które w pełnej wersji są dostępne w publikacji The Zebrafish Book3.

Metody zapłodnienia in vitro oraz otrzymywania diploidów gynogenetycznych u danio pręgowanego zostały opracowane przez Charline Walker w laboratorium George'a Streisingera na Uniwersytecie Oregon w latach 70. i 80. XX wieku. Metoda opisana w niniejszym materiale nie różni się od protokołów Charline, które w pełnej wersji są dostępne w The Zebrafish Book3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TrykainaSigma-Aldrich
Szkiełko zegarkowe
Prasa francuska
Butla ciśnieniowa
Instant ocean
Pipety PasteuraOdciąć wąski koniec, wypolerować ogniowo
Kroslinker UV
mikrokapilary

Bibliografia

  1. Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
  2. Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
  3. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
  4. Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
  5. Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
  6. Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
  7. Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda wczesnego wywierania naciskuplemniki dezaktywowane promieniami UVblokada mejozy IItraktowanie ci nieniem hydrostatycznymprzesiew genetyczny u zebrafishhomozygotyczne zarodki diploidalnetechnika mapowania centromer whaploidalne zarodki kontrolnekalibracja cylindra ci nieniowego

Powiązane artykuły