Jest to metoda generowania gynogenetycznych diploidalnych embrionów danio przeżębnika (embrionów, których jedynym wkładem genetycznym jest materiał macierzysty), poprzez blokowanie drugiego podziału mejozy bezpośrednio po zapłodnieniu plemnikami inaktywowanymi światłem ultrafioletowym. Embriony EP nie są w pełni homozygotyczne ze względu na rekombinację podczas pierwszego podziału mejozy, są jednak homozygotyczne we wszystkich loci, które nie zostały oddzielone od centromeru w wyniku rekombinacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanych za pomocą wczesnego wywierania nacisku
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Heterozygotyczność u diploidalnych eukariontów często utrudnia badania genetyczne. Metody pozwalające na uzyskanie żywotnych potomstwa diploidalnego, homozygotycznego bezpośrednio od samic heterozygotycznych umożliwiają bezpośredni przesiew samic F1 poddanych mutagenezie w celu wykrycia mutacji szkodliwych w przyspieszonym ekranie genetycznym typu forward. Streisinger et al.1,2opisano metody otrzymywania gynogenetycznych (homozygotycznych) diploidalnych danio pręgowanych poprzez aktywację jaj danio za pomocą nasienia inaktywowanego promieniowaniem ultrafioletowym oraz zapobieganie drugiej dywizji mejotycznej lub pierwszej dywizji komórkowej zygoty za pomocą zabiegów fizycznych (ciepła lub ciśnienia), które depolimeryzują mikrotubule. Metoda „wczesnego ciśnienia” (EP) blokuje mejozę II, która zachodzi krótko po zapłodnieniu. Metoda EP daje wysoki odsetek żywotnych embrionów, które mogą rozwinąć się w płodne dorosłe osobniki obu płci. Metoda ta generuje embriony homozygotyczne we wszystkich locus, z wyjątkiem tych, które zostały oddzielone od centromeru w wyniku rekombinacji podczas mejozy I. Homozygotyczne mutacje wykrywa się w kłakach EP w zakresie od 50% dla locus centromerowych do mniej niż 1% dla locus telomerowych. Metoda ta została odtworzona słowo w słowo z Zebrafish Book3.
Protokół
Przegląd wczesnego ciśnienia
Uwaga: receptury na wiele z odczynników stosowanych w tym protokole, takich jak tricaina, woda dla ryb oraz sól Hanksa, są dostępne online w rozdziale 10 książki The Zebrafish Book3 (http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html)
- Uzyskać embriony poprzez zapłodnienie in vitro z użyciem plemników inaktywowanych promieniami UV.
- Niezwłocznie przenieść zapłodnione jaja do szklanej fiolki (z plastikowym zamknięciem zatrzaskowym) wypełnionej po brzegi wodą dla jaj. Przykryć otwarty koniec fiolki cienką arkuszem gumy lateksowej i zatrzas....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ważne jest upewnienie się, że embriony otrzymane tą metodą są prawdziwymi diploidami gynogenetycznymi. W ramach kontroli należy wyhodować partię normalnych jaj diploidalnych (odkładając część plemników bez inaktywacji UV) oraz partię embrionów haploidalnych (odkładając partię jaj zapłodnionych plemnikami poddanymi działaniu UV, ale bez przeprowadzenia procedury EP). W 1. dniu po zapłodnieniu embriony haploidalne charakteryzują się krótką osią ciała oraz nieregularną morfologią mózgu i somytów. Haploidy nie są żywotne po .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Metody zapłodnienia in vitro oraz otrzymywania diploidów gynogenetycznych dla danio pręgowanego zostały opracowane przez Charline Walker w laboratorium George'a Streisingera na Uniwersytecie Oregon w latach 70. i 80. XX wieku. Opisana tutaj metoda nie różni się od protokołów Charline, które w pełnej wersji są dostępne w publikacji The Zebrafish Book3.
Metody zapłodnienia in vitro oraz otrzymywania diploidów gynogenetycznych u danio pręgowanego zostały opracowane przez Charline Walker w laboratorium George'a Streisingera na Uniwersytecie Oregon w latach 70. i 80. XX wieku. Metoda opisana w niniejszym materiale nie różni się od prot....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Trykaina | Sigma-Aldrich | ||
| Szkiełko zegarkowe | |||
| Prasa francuska | |||
| Butla ciśnieniowa | |||
| Instant ocean | |||
| Pipety Pasteura | Odciąć wąski koniec, wypolerować ogniowo | ||
| Kroslinker UV | |||
| mikrokapilary |
Bibliografia
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Weste....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
