$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zanim zaczniesz
Serca dorosłych
- Świeżo przygotowany sztuczny roztwór hemolimfy (AH) zawierający 108mM Na+, 5mM K+, 2mM Ca2+, 8mM MgCl2, 1mM NaH2PO4, 4mM NaHCO3, 10mM sacharozy, 5mM trehalozy, 5mM HEPES (pH 7,1, wszystkie odczynniki firmy Sigma Chemicals). Sacharoza i trehaloza powinny być dodane do AH z chłodzonych roztworów podstawowych tuż przed użyciem, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu.
- Doprowadź AH do temperatury pokojowej i natlenić roztwór przez bulgotanie powietrzem przez co najmniej 15 minut.
- Pociągnij kilka drobnych naczynek (np. Glass Capillaries, 100ul, VWR) wymaganych do usunięcia tłuszczu.
Larwalne serca
- Szkiełka nakrywkowe z powłoką Sylgard: za pomocą wykałaczki przenieś około 50-70 μl roztworu Sylgard na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22x22 mm. Pozostaw Sylgard do stwardnienia w temperaturze 65°C przez noc.
- Przygotować bufor Broadie i Bate's (135mM NaCl, 5mM KCl, 4mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM TES, 36mM Sacharoza; pH 7,15. Patrz Broadie i Bate, 1993).
- Przygotuj narzędzia potrzebne do nałożenia kleju histoakrylowego. Najpierw pociągnij kilka drobnych naczynek (np. Science Products GB100T8P). Połącz końcówkę pipety o pojemności 1,5 ml z małą plastikową rurką (Tygon, 1/32"), wkładając mniejszą końcówkę do probówki. Włóż kapilatę z szerokim otworem na drugi koniec. Naładuj kapilarnę klejem Histoacryl, zanurzając kapilarnę w kropli kleju i delikatnie zasysając do plastikowej końcówki. Podczas pracy z klejem należy mieć pod ręką drugą szklaną kapilarę, aby usunąć nadmiar kleju z końcówki kapilary klejowej. Klej jest płynny, dopóki nie wejdzie w kontakt z buforowaną solą fizjologiczną, gdzie stwardnieje w ciągu kilku sekund. Jednak zwykle pozostaje plastikowy wystarczająco długo, aby można go było usunąć z końcówki kapilarnej kleju lub podczas nakładania go na próbkę.
Częściowo nienaruszone serce Drosophila od dorosłej muchy
- Dorosłe muchy Drosophila są znieczulane preparatem Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) przez 2-5 minut. Należy uważać, aby nie pozostawiać much w Fly Nap na dłuższe ekspozycje. Krótkotrwała ekspozycja na zimno może być również wykorzystana do znieczulenia much, ale CO2 nie jest zalecany, ponieważ ma długotrwały wpływ na tętno i rytmiczność.
- Znieczulone muchy umieszcza się grzbietem do dołu na szalce Petriego pokrytej cienką warstwą wazeliny. Hydrofobowy naskórek na skrzydłach i ciele odwracalnie "przykleja się" do galaretki, ale w razie potrzeby muchę można przestawić. Staje się to szczególnie ważne podczas kolejnych manipulacji.
- Wstępne cięcie wykonuje się za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych (Roboz #5611). Ostrza nożyc umieszcza się pod nogami i kieruje w dół w kierunku grzbietowej powierzchni klatki piersiowej w pobliżu szyi. Głowa, brzuszny rdzeń nerwowy i nogi są usuwane jednym cięciem. Preparat jest następnie zanurzany w natlenionym, sztucznym roztworze hemolimfy (AH).
- Za pomocą nożyczek sprężynowych tylny koniec brzucha (składający się z segmentów brzusznych 7 i 8) usuwa się jednym cięciem. Zapewnia to dostęp do wykonywania bocznych nacięć wzdłuż obu krawędzi brzucha i służy do przerwania połączenia między tylnym jelitem a naskórkiem brzucha. Uwolniony płat brzusznego naskórka brzusznego jest następnie usuwany.
- W krokach 3 i 4 przednie i tylne połączenia jelita są przerywane, więc narządy jamy brzusznej są teraz utrzymywane na miejscu tylko przez tracheole. Jelita i inne narządy jamy brzusznej można zwykle usunąć jako pojedynczą masę za pomocą kleszczy jubilerskich (Roboz, #55) i delikatnego szarpania. Usunięcie narządów wewnętrznych odsłania bijącą rurkę serca, która nadal jest przyczepiona do naskórka grzbietowego, otoczona ciałami tłuszczowymi.
- Ciała tłuszczowe są dość nieprzezroczyste w mikroskopie świetlnym, w związku z czym często konieczne jest usunięcie części tego tłuszczu, aby wyraźnie zobaczyć rurkę serca. Osiąga się to za pomocą techniki liposukcji przy użyciu drobno narysowanych szklanych naczyń włosowatych. Kapilary są wykonywane za pomocą standardowego ściągacza do pipet (np. Sutter P-97 Pipette Puller), a następnie są wkładane do plastikowej rurki (Tygon, 1/16") podłączonej do źródła podciśnienia. System ten służy do odsysania nadmiaru tłuszczu z okolic rurki serca. Siła ssania jest proporcjonalna do średnicy końcówki, dlatego nie należy używać pipet z końcówkami o średnicy większej niż 40 mikronów. Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć dotykania samego serca, a ponieważ tylna część serca jest bardzo delikatna, należy całkowicie unikać tego obszaru.
- Dorosła rurka serca Drosophila jest teraz odsłonięta i powinna bić. W razie potrzeby naskórek i przyczepione serce można przestawić, delikatnie podnosząc naskórek z wazeliny i ostrożnie ubijając go z powrotem, ponownie unikając kontaktu z tkanką serca. W tym momencie roztwór kąpiący preparat należy zastąpić świeżym AHL. Preparat ten należy pozostawić do zrównoważenia przez 20-30 minut z natlenieniem przed jakimikolwiek manipulacjami. Jeśli preparat ma być przechowywany dłużej niż 60 minut, należy go przetworzyć świeżym AHL.
Unieruchamianie larw Drosophila do zapisu optycznego
- Umieść kroplę kleju Histoacryl w pobliżu każdego rogu szkiełek nakrywkowych Sylgard. Dodaj 50 μl buforu B&B do kropli kleju, który natychmiast stwardnieje. Przestrzeń między klejonymi miejscami wypełnij B&B – klej utrzyma bufor na szkiełku.
- Weź wędrującą larwę L3 i umieść ją na kawałku mokrej bibuły na lodzie na 2 minuty. Spowolni to jego ruch. Następnie przenieś larwę do bufora i ustaw ją grzbietem do góry (jest to strona larwy, która nie ma pasów zębatych). Szybko nałóż trochę kleju między obszarem głowy a Sylgardem. Klej bardzo szybko stwardnieje i zapobiegnie przesuwaniu się głowy larwy.
- Za pomocą kleszczy ostrożnie chwyć zwierzę za tylne przetchlinki i delikatnie je rozciągnij. Zamocuj larwę w tej pozycji, nakładając klej po obu stronach larwy w tylnej połowie. Aby zmniejszyć dalszy ruch naskórka przez mięśnie ściany ciała, dodaj więcej kleju do boków zwierzęcia. Larwa jest teraz unieruchomiona w tej pozycji. Szkiełko nakrywkowe można umieścić na małej szalce Petriego wypełnionej AHL lub PBS. Bicie serca może być teraz rejestrowane bez zakłóceń spowodowanych ruchami ścian ciała.
Reprezentatywne wyniki:
Na wpół nienaruszone serce dorosłego Drosophila będzie biło rytmicznie przez wiele godzin po sekcji, gdy będzie utrzymywane w świeżym, natlenionym AH (zobacz Dane uzupełniające, Ocorr, et al., 2007). Reprezentatywny przykład pokazano na filmie 1. Serca larw w 3.stadium rozwojowym i młode muchy (1 – 3 tygodnie po ekleksji) na ogół wykazują regularne bicie serca w tempie od 1 do 3 Hz. Muchy starsze niż 3 tygodnie są na ogół bardziej arytmiczne; niemniej jednak serca te są nadal w stanie bić spontanicznie przez wiele godzin w natlenionym AHL. Serca u dorosłych muszek, które są uszkodzone w wyniku procedury preparacji, zazwyczaj wykazują zlokalizowane obszary ekstremalnego zwężenia, które nie są w stanie się rozluźnić. Częstość bicia serca wolniejsza niż 1 Hz jest rzadko obserwowana u much w wieku poniżej 3 tygodni; W związku z tym takie preparaty uważa się za uszkodzone i wyrzuca się je.
Kliknij tutaj, aby pobrać film 1.- Jednotygodniowa dorosła mucha typu dzikiego (w szczepie laboratoryjnym1118) z odsłoniętą rurką serca w jamie brzusznej (z przodu po lewej stronie). Zwróć uwagę na regularne, rytmiczne skurcze. Nieprzezroczyste obszary w prawym górnym rogu to pozostałe ciała tłuszczowe w jamie brzusznej; Okrągłe komórki po obu stronach serca to komórki osierdzia.