Wizualizacja bijącego serca u Drosophila

Podsumowanie

Przedstawiono technikę niezbędną do wizualizacji bijącego serca w larwalnym i dorosłym stadium rozwoju Drosophila. Każdy etap cyklu życiowego wymaga zastosowania odmiennej metodologii.

Streszczenie

TheDrosophilaserce stało się ostatnio dobrym systemem modelowym do badania genetycznych, komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw funkcji serc miogennych. Kluczowym krokiem w badaniu funkcji serca u muchy jest znalezienie sposobu na uzyskanie dostępu do serca w sposób, który zachowuje jego funkcję miogenną, a jednocześnie pozwala na obserwację i rejestrację bijącego organu. Przedstawiono dwie różne metody obserwacji i rejestracji bijącego serca zarówno u larw, jak i u osobników dorosłychDrosophilaopisane są tutaj. Nasza metoda przygotowania preparatu półintegralnego z użyciem dorosłych much pozwala na wyraźną wizualizację serca brzusznego bez zakłóceń ze strony pigmentowanej kutykuli oraz nadległych ciał tłuszczowych. Aby zarejestrować bicie serca larwy, konieczne jest unieruchomienie larwy, co minimalizuje ruchy ścian ciała, redukując tym samym ruchy serca niezwiązane ze skurczami mięśnia sercowego. Nasze metodologie pozwalają na uzyskanie stabilnych preparatów serca dorosłych osobników i larw, które mogą bić przez wiele godzin z częstotliwością 1-3 Hz.

Protokół

Przed rozpoczęciem

Serca dorosłych

1. Przygotować świeży roztwór sztucznej hemolimfy (AH) zawierający 108mM Na⁺, 5mM K+, 2mM Ca²⁺, 8mM MgCl₂, 1mM NaH₂PO₄, 4mM NaHCO₃, 10mM sacharozy, 5mM trehalozy oraz 5mM HEPES (pH 7,1; wszystkie odczynniki firmy Sigma Chemicals). Sacharozę i trehalozę należy dodać do AH z chłodzonych roztworów zapasowych bezpośrednio przed użyciem, aby zapobiec kontaminacji bakteryjnej.
2. Doprowadzić AH do temperatury pokojowej i napowietrzyć roztwór poprzez bąblowanie powietrzem przez co najmniej 15 min.
3. Wyciągnąć kilka cienkich kapilar (np. Glass Capillaries, 100ul, VWR) niezbędnych do usunięcia tkanki tłuszczowej.

Serca larwalne

1. Kryszalki pokryte Sylgardem: za pomocą wykałaczki przenieś około 50-70μl roztworu Sylgard na kryszalkę o wymiarach 22x22mm. Pozostaw Sylgard do utwardzenia w temperaturze 65°C przez noc.
2. Przygotuj bufor Broadie i Bate’a (135mM NaCl, 5mM KCl, 4mM MgCl₂, 2mM CaCl₂, 5mM TES, 36mM sacharozy; pH 7,15. Patrz Broadie i Bate, 1993).
3. Przygotuj narzędzia niezbędne do aplikacji kleju histoacryl. Najpierw wyciągnij kilka cienkich kapilar (np. Science Products GB100T8P). Połącz końcówkę pipety 1,5ml z małym plastikowym wężykiem (Tygon, 1/32”), wsuwając mniejszy koniec do rurki. Wsuń kapilarę szerszym otworem w drugi koniec. Napełnij kapilarę klejem Histoacryl, zanurzając ją w kropli kleju i delikatnie zasysając go do plastikowej końcówki. Podczas pracy z klejem należy mieć pod ręką drugą szklaną kapilarę, aby usunąć nadmiar kleju z końcówki kapilary aplikacyjnej. Klej pozostaje w stanie ciekłym do momentu kontaktu z buforowaną solą fizjologiczną, w której utwardza się w ciągu kilku sekund. Zazwyczaj pozostaje jednak plastyczny wystarczająco długo, aby można go było usunąć z końcówki kapilary lub nanieść na preparat.

Preparacja częściowo nienaruszonego serca Drosophila z dorosłej muchy

1. Dorosłe muchy Drosophila są znieczulane preparatem Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) przez 2-5 minut. Należy zadbać o to, aby nie pozostawiać much w Fly Nap przez dłuższy czas. Do znieczulania much można również wykorzystać krótkotrwałą ekspozycję na zimno, jednak nie zaleca się stosowania CO₂, ponieważ wywiera on dłużej utrzymujące się działanie na częstość i rytmikę bicia serca.
2. Znieczulone muchy umieszcza się stroną grzbietową do dołu w szalce Petriego pokrytej cienką warstwą wazeliny. Hydrofobowa kutykula skrzydeł i ciała odwracalnie „przykleja się” do wazeliny, ale w razie potrzeby można zmienić położenie muchy. Staje się to szczególnie istotne podczas późniejszych manipulacji.
3. Pierwsze cięcie wykonuje się za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych (Roboz #5611). Ostrza nożyczek umieszcza się pod odnóżami i kieruje je w dół w stronę powierzchni grzbietowej klatki piersiowej w pobliżu szyi. Głowę, brzuszny sznur nerwowy i odnóża usuwa się jednym cięciem. Preparat zanurza się następnie w natlenionym roztworze sztucznej hemolimfy (AH).
4. Za pomocą nożyczek sprężynowych jednym cięciem usuwa się tylną końcówkę odwłoka (składającą się z segmentów odwłoka 7 i 8). Umożliwia to wykonanie cięć bocznych wzdłuż obu krawędzi odwłoka i służy do przerwania połączenia między tylną częścią jelita a kutykulą odwłoka. Następnie usuwa się uwolnioną płat kutykuli brzusznej odwłoka.
5. W krokach 3 i 4 przecina się przednie i tylne połączenia jelita, tak że narządy odwłoka są teraz utrzymywane na miejscu jedynie przez tracheole. Jelito i inne narządy odwłoka można zazwyczaj usunąć jako jedną masę, używając pęsety jubilerskiej (Roboz, #55) i delikatnie pociągając. Usunięcie narządów wewnętrznych odsłania bijącą rurkę serca, która wciąż jest przymocowana do kutykuli grzbietowej i otoczona ciałami tłuszczowymi.
6. Ciała tłuszczowe są dość nieprzezroczyste w mikroskopie świetlnym, w związku z czym często konieczne jest usunięcie części tego tłuszczu, aby wyraźnie widzieć rurkę serca. Osiąga się to za pomocą techniki liposukcji przy użyciu cienkich kapilar szklanych. Kapilary wykonuje się za pomocą standardowego wyciągacza do pipet (np. Sutter P-97 Pipette Puller), a następnie wstawia się je do plastikowych rurek (Tygon, 1/16”) podłączonych do źródła próżni. System ten służy do odsysania nadmiaru tłuszczu z okolic rurki serca. Siła ssania jest proporcjonalna do średnicy końcówki, dlatego nie należy używać pipet o końcówkach o średnicy większej niż 40 mikronów. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dotknąć samego serca, a ponieważ tylna część serca jest bardzo krucha, należy całkowicie unikać tego obszaru.
7. Rurka serca dorosłej Drosophila jest teraz odsłonięta i powinna bić. W razie potrzeby można zmienić położenie kutykuli wraz z przymocowanym sercem, delikatnie podnosząc kutykulę z wazeliny i ostrożnie przykładając ją z powrotem, unikając ponownie jakiegokolwiek kontaktu z tkanką serca. W tym momencie roztwór kąpieli preparatu należy zastąpić świeżym AHL. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek manipulacji należy pozwolić preparatowi na równowagę przez 20-30 minut przy jednoczesnym natlenianiu. Jeśli preparat ma być utrzymywany przez więcej niż 60 minut, należy go perfundować świeżym AHL.

Unieruchamianie larw Drosophila do rejestracji optycznej

1. Nanieś kroplę kleju Histoacryl w pobliżu każdego narożnika szkiełek przykrywek Sylgard. Dodaj 50μl buforu B&B do kropel kleju, który natychmiast stwardnieje. Wypełnij przestrzeń między punktami klejenia buforem B&B – klej utrzyma bufor na szkiełku.
2. Pobierz wędrującą larwę w stadium L3 i umieść ją na kawałku mokrej chusteczki higienicznej na lodzie przez 2 min. Spowolni to jej ruchy. Następnie przenieś larwę do buforu i zorientuj ją grzbietem do góry (jest to strona larwy pozbawiona pasów z kolcami). Szybko nanieś niewielką ilość kleju między obszar głowy a Sylgard. Klej stwardnieje bardzo szybko i zapobiegnie przemieszczaniu się głowy larwy.
3. Używając pęsety, ostrożnie chwyć zwierzę za przesuwy tylne i delikatnie je rozciągnij. Utrwal larwę w tej pozycji, nakładając klej wzdłuż obu stron ciała w tylnej połowie. Aby ograniczyć dalsze ruchy kutykuli wywołane przez mięśnie ściany ciała, dodaj więcej kleju na boki zwierzęcia. Larwa jest teraz unieruchomiona w tej pozycji. Szkiełko przykrywkę można umieścić w małej szalce Petriego wypełnionej AHL lub PBS. Można teraz rejestrować skurcze serca bez zakłóceń wywołanych ruchami ściany ciała.

Reprezentatywne wyniki:

Półzachowane serce dorosłej muszki *Drosophila* po wycięciu będzie bić rytmicznie przez wiele godzin, jeśli zostanie utrzymane w świeżym, natlenionym roztworze AH (patrz Supplemental Data, Ocorr, et al., 2007). Reprezentatywny przykład przedstawiono w Movie 1. Serca od 3^{Badania i rozwój} Larwy w stadium rozwojowym oraz młode muchy (1–3 tygodnie po wykluciu) zazwyczaj wykazują regularny rytm pracy serca z częstotliwością od 1 do 3 Hz. Muchy starsze niż 3 tygodnie są zazwyczaj bardziej arytmiczne; niemniej jednak ich serca wciąż są zdolne do spontanicznego bicia przez wiele godzin w napowietrzonym roztworze AHL. Serca dorosłych much, które uległy uszkodzeniu w wyniku procedury sekcji, typowo wykazują zlokalizowane obszary ekstremalnego skurczu, które nie są w stanie się rozkurczyć. Częstotliwość bicia serca niższa niż 1 Hz jest rzadko obserwowana u much młodszych niż 3 tygodnie; w związku z tym takie preparaty są uznawane za uszkodzone i są odrzucane.

Kliknij tutaj, aby pobrać Film 1.- Jednotygodniowa dorosła mucha typu dzikiego (szczep laboratoryjny w¹¹¹⁸) z odsłoniętą rurką serca brzusznego (przód po lewej stronie). Zauważ regularne, rytmiczne skurcze. Nieprzezroczyste obszary w prawym górnym rogu to pozostałości ciał tłuszczowych brzusznych; okrągłe komórki po obu stronach serca to komórki osierdzia.

Dyskusja

Model Drosophila okazał się potężnym narzędziem genetycznym, które wykorzystywano do badania różnorodnych zagadnień naukowych, od rozwoju embrionalnego po uczenie się i pamięć. Ostatnio ten wszechstronny organizm modelowy został użyty do badania genetyki funkcji serca u muchy. Wiele prób ilościowego określenia fizjologii serca u dorosłych Drosophila opierało się na obserwacjach przeprowadzanych u nienaruszonych much przez kutykulę brzuszną. Większość tych podejść bazowała na obserwacji wizualnej lub rejestracji zmian nat...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikro-nożyczki sprężynowe do mikrodissekcji (zakrzywione)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Dobre do cięć wstępnych (Krok 3)
Mikro-nożyczki sprężynowe do mikrodissekcji (proste)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Pinceta Dumont #55	Fine Science Tools	11295-51
Pinceta Dumont #5	Fine Science Tools	11295-10
Kapilary szklane, 100ul	VWR international	53432-921
Kapilary szklane, cienkie	Science Products	GB100T8P
Wytwornica pipet	Sutter Equipment	P-97	Zastosowanie możliwe zarówno dla wytwornic poziomych, jak i pionowych
Przewód plastikowy	Tygon	1/16” średnicy wewnętrznej	do kapilar 100μl
Przewód plastikowy	Tygon	1/32” średnicy wewnętrznej	do małych kapilar
Klej tkankowy Histoacryl®	B. Braun Medical