Test odporności (PTI) wywołanej przez wzorzec molekularny związany z patogenem (PAMP) u roślin

Summary

Opisano test oparty na śmierci komórki dla PTI w roślinach Nicotiana benthamiana.

Abstract

Aby dostrzec potencjalne patogeny w swoim otoczeniu, rośliny używają receptorów rozpoznawania wzorców (PRR) obecnych na ich błonach plazmatycznych. PRR rozpoznają konserwatywne cechy mikrobiologiczne zwane wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP), a to wykrycie prowadzi do odporności wyzwalanej przez PAMP (PTI), która skutecznie zapobiega kolonizacji tkanek roślinnych przez osoby niebędące patogenami^1,2. Najlepiej zbadanym układem w PTI jest szlak^{zależny od} FLS2 3. FLS2 rozpoznaje PAMP flg22, który jest składnikiem flageliny bakteryjnej.

Skuteczne patogeny posiadają czynniki wirulencji lub efektory, które mogą tłumić PTI i pozwalać patogenowi na wywołanie choroby¹. Niektóre rośliny z kolei posiadają geny oporności, które wykrywają efektory lub ich aktywność, co prowadzi do odporności wyzwalanej efektorowo (ETI)².

Opisujemy test oparty na śmierci komórki dla PTI, zmodyfikowany z Oh i Collmer⁴. Test został ustandaryzowany w N. benthamiana, który jest coraz częściej stosowany jako system modelowy do badania interakcji roślina-patogen⁵. PTI jest indukowany przez infiltrację niepatogennego szczepu bakteryjnego do liści. Siedem godzin później szczep bakteryjny, który albo powoduje chorobę, albo aktywuje ETI, infiltruje się do obszaru pokrywającego się z pierwotną strefą infiltracji. PTI indukowane przez pierwszy naciek jest w stanie opóźnić lub zapobiec pojawieniu się śmierci komórki z powodu drugiej infiltracji prowokacyjnej. I odwrotnie, pojawienie się śmierci komórki w nakładającym się obszarze inokulacji wskazuje na rozpad PTI.

Ustandaryzowano cztery różne kombinacje induktorów PTI i szczepień prowokacyjnych (Tabela 1). Test został przetestowany na niewyciszonych roślinach N. benthamiana, które służyły jako kontrola, oraz roślinach wyciszonych dla FLS2, które przewidywano, że będą miały zagrożoną zdolność do rozwoju PTI.

Protocol

Część 1: Wzrost i pielęgnacja roślin

Rośliny Nicotiana benthamiana użyte w teście powinny mieć około 7 tygodni. Należy je przyciąć co najmniej 4-5 dni przed testem, aby usunąć wszystkie gałęzie pachowe i kwiaty. Dobrym pomysłem jest usunięcie gałęzi pachowych wkrótce po ich pojawieniu się, aby rośliny były łatwiejsze w uprawie.

Część 2: Hodowla bakterii

DZIEŃ 1:

1. Płytki lub kultury dla wszystkich szczepów użytych w teście są inicjowane w tym samym czasie. W przypadku Pseudomonas spp., które zawierają 2 induktory i 3 szczepy prowokacyjne, należy umieścić bakterie na płytkach KBM zawierających odpowiednie antybiotyki z zamrożonych zapasów glicerolu (Tabela 2). Niewielką ilość bakterii należy rozprowadzić na środku płytki. Inkubować płytkę w temperaturze 30°C przez około 18-24 godziny. W przypadku Agrobacterium rozpocznij płynną hodowlę w 2 ml LB ze świeżej płytki i hoduj przez noc w temperaturze 250 obr./min, 30°C.

DZIEŃ 2:

2. W przypadku Pseudomonas dodaj do bakterii 150-200 μl płynnego KBM i rozprowadź je na całej płytce za pomocą sterylnego rozsiewacza szkła. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora i pozwól jej rosnąć przez kolejne 20-24 godziny. Następnego dnia na talerzu powinien znajdować się trawnik bakteryjny, wskazujący na dobry wzrost. W przypadku Agrobacterium rozpocznij hodowlę wtórną w około 5-10 ml LB z 20 μM acetosyringonem i pozwól mu rosnąć przez noc do 20 godzin w temperaturze 250 obr./min, 30°C.

Część 3: Przygotowanie roślin do testu

DZIEŃ 2:

1. Na dzień przed badaniem rośliny należy przenieść do pomieszczenia o temperaturze 22-24°C, wilgotności względnej ~35-40% i stałym oświetleniu.
2. Zaznacz kółka na liściach o średnicy co najmniej 1,5 cm za pomocą grubego czarnego markera. Na każdym liściu można zaznaczyć od dwóch do czterech kółek. Okręgi powinny być dobrze rozmieszczone i najlepiej, aby nie przecinały dużej żyły. Wybierz dobrze rozwinięte liście. Unikaj starszych liści lub liści, które są twarde lub grube w dotyku i unikaj zaznaczania kółek na dolnych częściach liścia.

Zaznaczanie okręgów na dzień przed eksperymentem nie jest niezbędne dla protokołu. Oszczędza to jednak czas, jeśli badana jest duża liczba roślin, i ułatwia osiągnięcie precyzyjnego czasu między indukcją PTI a szczepieniami prowokacyjnymi.

Część 4: Indukcja PTI

DZIEŃ 3:

1. Zebrać komórki z płytki w 10 mM MgCl₂ dla P. fluorescens i P. putida. W przypadku Agrobacterium odwirować hodowlę w celu zebrania komórek i ponownie zawiesić w 10 mM MgCl₂ + 10 mM MES pH 5,6. Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić w roztworze MgCl₂ -MES. Zmierz gęstość optyczną (OD) komórek przy 600 nM. Dostosuj średnicę zewnętrzną do ostatecznych wymaganych wartości, jak opisano w Tabeli 2. Pseudomonas należy ostatecznie zawiesić w 10 mM MgCl₂ i Agrobacterium w roztworze MgCl₂ –MES. Całkowita objętość 25 ml wystarcza do zaszczepienia około 40-50 plamek.
2. Naciekać induktory PTI do wstępnie zaznaczonych okręgów na liściach za pomocą strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml. Zapisz kolejność, w jakiej rośliny zostały zinfiltrowane i dokładny czas, w którym infiltracja została rozpoczęta.

Część 5: Szczepienie na wyzwanie

1. Przygotować P. syringae pv. pomidor DC3000, P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1 i P.s. pv. tabaci dla wyzwania, jak opisano w części 4.1 i tabeli 2.
2. Siedem godzin po infiltracji induktora wykonaj infiltrację prowokacyjną w tej samej kolejności roślin, w jakiej przeprowadzono indukcję. Ogólnie rzecz biorąc, punkt na obrzeżach pierwszego okręgu inokulacji może być użyty jako środek drugiego okręgu inokulacji. Jeśli na liściu jest wiele plam, upewnij się, że nacieki nie zachodzą na siebie.
3. Seryjne rozcieńczenia wszystkich kultur użytych w teście na płytkach KBM lub LB zawierających odpowiednie antybiotyki w celu określenia dokładnej liczby CFU.

Część 6: Punktacja dla podziału PTI

Dzień 5:

1. Zwróć uwagę na pojawienie się śmierci komórki z powodu ETI w miejscach, które zostały zakwestionowane przez P.s.t. DC3000. Śmierć komórki wewnątrz nakładającego się obszaru nacieku wskazuje na rozpad PTI i powinna być oceniana jako fenotyp dodatni.

Dzień 7:

2. Poszukaj pojawienia się śmierci komórki z powodu choroby w miejscach, które zostały poddane P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1 lub P.s. pv. tabaci. Ocenić dodatni fenotyp w taki sam sposób, jak opisano w części 6.1.

Gdy rośliny kontrolne (które nie powinny być zagrożone dla PTI) zaczną wykazywać śmierć komórek w nakładającym się obszarze infiltracji, przestań prowadzić dalsze obserwacje.

Część 7: Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 pokazuje wynik testu, w którym P. fluorescens został użyty jako induktor, a P.s.t. DC3000 jako wyzwanie.

Rysunek 1. P. fluorescens został nacieknięty na liściach N. benthamiana (czarne kółko) w celu wywołania PTI, a 7 godzin później plamka została poddana prowokacji P.s.t DC3000 (białe kółko). Rośliny wyciszone dla FLS2 wykazały rozpad PTI w regionie, w którym P. fluorescens był infiltrowany (A), co widać po śmierci komórki. Rośliny kontrolne, które nie zostały wyciszone, nie wykazały śmierci komórek w nakładającym się obszarze z powodu indukcji PTI (B). Czerwone strzałki wskazują na brak lub obecność śmierci komórki w nakładającym się obszarze infiltracji. Zdjęcia zostały zrobione 2 dni po infiltracji. Proszę kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku 1.

Induktor PTI Wyzwanie wywołujące śmierć komórki Natura śmierci komórki kod Pseudomonas fluorescens 55 Pomidor Pseudomonas syringae pv (P.s.t.) Kontroler DC3000⁶ ETI (Międzynarodowa Sieć T Pf/DC P. putida KT2440 P.s.t. DC3000 ETI (Międzynarodowa Sieć T Pp/DC (Prąd Stały) P. fluorescens 55 P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1⁶ choroba Pf/Q1-1 Agrobacterium tumefaciens GV2260 P. syringae pv. tabaci 11528R choroba Agro/Ptab

Tabela 1: Kombinacje mikrobów indukujących PTI i wywołujących śmierć komórkową stosowanych w teście śmierci komórkowej dla PTI.

Szczep bakteryjny Medium selekcyjne Ostateczny odnośnik użyty w eksperymencie Odpowiednie C.F.U./ml P. fluorescens 55 KBM Ampicylina (100 ug/ml) 0,5 1 x 10⁹ P. putida KT2440 KBM Ampicylina (100 ug/ml) 0,5 1 x 10⁸ A. tumefaciens GV2260 LB Ryfampicyna (100 ug/ml) 0,5 5 x 10⁸ P.s.t. DC3000 KBM Ryfampicyna (100 ug/ml) 0,02 pkt. 2 x 10⁷ P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1 KBM Ryfampicyna (100 ug/ml) 100-krotne rozcieńczenie 0,1 1 x 10⁶ P. syringae pv. tabaci 11528R KBM Ryfampicyna (100 ug/ml) 100-krotne rozcieńczenie 0,1 1 x 10⁶

Tabela 2:Warunki hodowli i poziomy inokulum użyte w teście. Poziomy średnicy zewnętrznej i odpowiadające im CFU mogą się różnić w zależności od marki spektrofotometrów.

Discussion

Test oparty na śmierci komórki może być wykorzystany do określenia udziału genu w PTI. Na przykład mutanty utraty funkcji dla genu będącego przedmiotem zainteresowania można przetestować za pomocą tego testu. Spośród 4 kombinacji inokulacji indukcyjnych i prowokacyjnych podanych w Tabeli 1, możliwe jest, że tylko jedna kombinacja może skutkować fenotypem w tle roślinnym. Zaobserwowaliśmy, że rośliny wyciszone dla FLS2 wykazują rozkład PTI w kombinacjach Pf / DC i Pf / Q1-1 induktorów i inokulacji prowokacyjnych (Tabela 1).

Istotne jest, aby warunki środowiskowe dla testu były jak najbardziej zbliżone do warunków opisanych w części 3.1. Niska wilgotność powoduje, że śmierć komórek przebiega zbyt szybko, co utrudnia ocenę testu. Jeśli warunki opisane w naszym protokole nie działają w Twoim laboratorium, spróbuj zmienić poziom induktora lub szczepienia prowokacyjnego. Innym parametrem, który można zmodyfikować, jest odstęp czasowy między indukcją a prowokacją, chociaż stwierdziliśmy, że krótsze przerwy czasowe powodowały zbyt szybkie załamywanie się testu w zakładach kontrolnych.

Zalecamy, aby co najmniej 4-5 roślin zostało przetestowanych w eksperymencie, a pozytywny fenotyp należy powtórzyć w co najmniej 3-4 niezależnych eksperymentach.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Fisher Scientific	BP300-100	Przygotuj jako zapas a1M, dostosuj pH i sterylizuj filtrem. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Spektrofotometr UV/Vis w naukach przyrodniczych	Beckman Coulter Inc.	DU 730