Opisano test oparty na śmierci komórek w celu badania PTI u roślin Nicotiana benthamiana.
Artykuł metodologiczny
Analiza odporności wywołanej przez wzorce molekularne związane z patogenami (PTI) u roślin
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby wykrywać potencjalne patogeny w swoim środowisku, rośliny wykorzystują receptory rozpoznające wzorce (PRRs) obecne w ich błonach plazmatycznych. PRRs rozpoznają konserwatywne cechy drobnoustrojów zwane wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMPs), a detekcja ta prowadzi do odporności wyzwalanej przez PAMP (PTI), która skutecznie zapobiega kolonizacji tkanek roślinnych przez niepatogeny1,2. Najlepiej poznanym systemem w ramach PTI jest szlak zależny od FLS23. FLS2 rozpoznaje PAMP flg22, który jest komponentem bakteryjnej flagelliny.
Skuteczne patogeny posiadają czynniki wirulencji lub efektory, które potrafią tłumić PTI i umożliwiają patogenowi wywołanie choroby1. Z kolei niektóre rośliny posiadają geny odporności, które wykrywają efektory lub ich aktywność, co prowadzi do odporności indukowanej efektorami (ETI)2.
Opisujemy test oparty na śmierci komórek w odpowiedzi na PTI, zmodyfikowany na podstawie metody Oh i Collmera4. Test został zestandaryzowany w N. benthamiana, która jest coraz częściej wykorzystywana jako system modelowy do badania interakcji między roślinami a patogenami5. PTI jest indukowane poprzez infiltrację liści niepatogennym szczepem bakterii. Siedem godzin później w obszar nakładający się na pierwotną strefę infiltracji wprowadza się szczep bakteryjny, który albo wywołuje chorobę, albo aktywuje ETI. PTI indukowane przez pierwszą infiltrację jest w stanie opóźnić lub zapobiec wystąpieniu śmierci komórek w wyniku drugiej infiltracji wyzwalającej. I odwrotnie, wystąpienie śmierci komórek w obszarze nakładania się inokulacji wskazuje na załamanie mechanizmów PTI.
Zestandaryzowano cztery różne kombinacje induktorów PTI oraz inokulacji wyzwaniem (Tabela 1). Test przeprowadzono na roślinach N. benthamiana bez wyciszenia genu, które służyły jako kontrola, oraz na roślinach z wyciszonym genem FLS2, u których przewidywano upośledzenie zdolności do wywołania PTI.
Protokół
Część 1: Wzrost i pielęgnacja roślin
Nicotiana benthamiana wykorzystywane w teście powinny mieć około 7 tygodni. Należy je przyciąć co najmniej 4-5 dni przed testem, aby usunąć wszystkie pędy boczne i kwiaty. Zaleca się usuwanie pędów bocznych krótko po ich pojawieniu się, aby ułatwić pielęgnację roślin.
Część 2: Hodowla bakterii
DZIEŃ 1:
- Szaletki lub hodowle dla wszystkich szczepów wykorzystywanych w teście są rozpoczynane w tym samym czasie. W przypadku Pseudomonas spp., obejmujących 2 szczepy induktorowe i 3 szczepy wyzywające, należy wysiać bakterie z mrożonych stoków glicerynowych na płytki KBM zawierające odpowiednie antybiotyki (Tabela 2). Niewielką ilość bakterii należy rozprzestrzenić w centrum płytki. Inkubować płytkę w temperaturze 30°C przez około 18-24 godziny. Dla Agrobacterium należy przygotować hodowlę płynną w 2 ml LB z nowej płytki i hodować przez noc przy 250 r.p.m. w temperaturze 30°C.
DZIEŃ 2:
- W przypadku Pseudomonas dodać 150-200 μl płynnego podłoża KBM do bakterii i rozprowadzić je po całej powierzchni płytki za pomocą sterylnego szklanego rozprowadzacza. Płytkę umieścić ponownie w inkubatorze i pozostawić do wzrostu na kolejne 20-24 godziny. Następnego dnia na płytce powinien pojawić się trawnik bakteryjny, co świadczy o prawidłowym wzroście. W przypadku Agrobacterium zaszczepić kulturę wtórną w około 5-10 ml pożywki LB z dodatkiem 20 μM acetosyringonu i inkubować przez noc (do 20 godzin) przy 250 r.p.m. w temperaturze 30°C.
Część 3: Przygotowanie roślin do analizy
DZIEŃ 2:
- Na jeden dzień przed analizą rośliny należy przenieść do pomieszczenia o temperaturze 22-24°C, wilgotności względnej ~35-40% RH i stałym oświetleniu.
- Za pomocą grubego czarnego markera należy zaznaczyć na liściach okręgi o średnicy co najmniej 1,5 cm. Na jednym liściu można zaznaczyć od dwóch do czterech okręgów. Okręgi powinny być rozmieszczone w odpowiednich odstępach i najlepiej nie powinny przecinać dużych żyłek. Należy wybrać w pełni rozwinięte liście. Unikaj starszych liści lub liści, które w dotyku są twarde lub grube, a także zaznaczania okręgów na dolnych częściach liścia.
Zaznaczenie kręgów na dzień przed eksperymentem nie jest niezbędne dla protokołu. Pozwala to jednak zaoszczędzić czas w przypadku analizy dużej liczby roślin i ułatwia zachowanie precyzyjnych odstępów czasowych między indukcją PTI a inokulacją wyzwaniem.
Część 4: Indukcja PTI
DZIEŃ 3:
- Zebrać komórki z płyt w 10 mM MgCl2 dla P. fluorescens oraz P. putida. W przypadku Agrobacterium odwirować kulturę w celu zebrania komórek, a następnie zawiesić je ponownie w 10mM MgCl2 + 10 mM MES pH 5.6. Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić w roztworze MgCl2 –MES. Zmierzyć gęstość optyczną (O.D.) komórek przy 600 nM. Dostosować wartości O.D. do końcowych wymaganych wartości opisanych w Tabeli 2. Pseudomonas należy ostatecznie zawiesić w 10 mM MgCl2, a Agrobacterium w roztworze MgCl2 –MES. Objętość całkowita 25 ml jest wystarczająca do inokulacji około 40-50 punktów.
- Infiltrować induktory PTI do wcześniej zaznaczonych kół na liściach, używając strzykawki 1 ml bez igły. Zapisać kolejność infiltracji roślin oraz dokładny czas rozpoczęcia procesu infiltracji.
Część 5: Inokulacja w ramach próby zakaźnej
- Przygotować P. syringae pv. tomato DC3000, P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1 oraz P.s. pv. tabaci do inokulacji zgodnie z opisem w części 4.1 i w Tabeli 2.
- Siedem godzin po infiltracji induktora przeprowadzić infiltrację patogenem w tej samej kolejności roślin, w jakiej wykonano indukcję. Zazwyczaj jako środek drugiego kręgu inokulacji można przyjąć punkt na obwodzie pierwszego kręgu. W przypadku wielu punktów na jednym liściu należy upewnić się, że miejsca infiltracji na siebie nie nachodzą.
- Rozsiewać rozcieńczenia seryjne wszystkich kultur użytych w analizie na płytki KBM lub LB zawierające odpowiednie antybiotyki w celu określenia dokładnej liczby C.F.U.
Część 6: Ocena stopnia rozpadu PTI
Dzień 5:
- Należy sprawdzić, czy w miejscach zaszczepionych P.s.t. DC3000 wystąpiła śmierć komórek w wyniku ETI. Śmierć komórek w obszarze nakładania się infiltracji wskazuje na załamanie PTI i powinna zostać oceniona jako fenotyp pozytywny.
Dzień 7:
- Należy sprawdzić, czy w plamkach zainfekowanych szczepami P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1 lub P.s. pv. tabaci wystąpiła śmierć komórek wywołana chorobą. Fenotyp dodatni należy ocenić w taki sam sposób, jak opisano w części 6.1.
Gdy rośliny kontrolne (których PTI nie powinno być zaburzone) zaczną wykazywać śmierć komórek w obszarze nakładania się infiltracji, należy zaprzestać dalszych obserwacji.
Część 7: Reprezentatywne wyniki
Rycina 1 przedstawia wynik testu, w którym w roli induktora wystąpiła P. fluorescens, a w roli czynnika wywołującego P.s.t. DC3000.
Rycina 1. P. fluorescens wprowadzono do liści N. benthamiana (czarne koło), aby wywołać PTI, a 7 godzin później w tym samym miejscu wprowadzono P.s.t DC3000 (białe koło). Rośliny z wyciszonym genem FLS2 wykazały załamanie PTI w obszarze infiltracji P. fluorescens (A), co objawiło się śmiercią komórek. Rośliny kontrolne, w których nie dokonano wyciszenia, nie wykazały śmierci komórek w obszarze nakładania się infiltracji ze względu na indukcję PTI (B). Czerwone strzałki wskazują brak lub obecność śmierci komórek w obszarze nakładania się infiltracji. Zdjęcia wykonano 2 dni po infiltracjach. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.
| Induktor PTI | Wyzwanie wywołujące śmierć komórek | Charakter śmierci komórek | Kod |
| Pseudomonas fluorescens 55 | Pseudomonas syringae pv tomato (P.s.t.) DC30006 | ETI | Pf/DC |
| P. putida KT2440 | P.s.t. DC3000 | ETI | Pp/DC |
| P. fluorescens 55 | P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-16 | Choroba | Pf/Q1-1 |
| Agrobacterium tumefaciens GV2260 | P. syringae pv. tabaci 11528R | Choroba | Agro/Ptab |
Tabela 1: Kombinacje mikroorganizmów indukujących PTI i wywołujących śmierć komórek, użyte w teście śmierci komórkowej dla PTI.
| Szczep bakteryjny | Pożywka selekcyjna | Końcowa gęstość optyczna (O.D.) użyta w eksperymencie | Odpowiadające liczba jednostek tworzących kolonie (C.F.U./ml) |
| P. fluorescens 55 | KBM Ampicillina (100 ug/ml) | 0.5 | 1 x 109 |
| P. putida KT2440 | KBM Ampicillina (100 ug/ml) | 0.5 | 1 x 108 |
| A. tumefaciens GV2260 | LB Rifampicyna (100 ug/ml) | 0.5 | 5 x 108 |
| P.s.t. DC3000 | KBM Rifampicyna (100 ug/ml) | 0.02 | 2 x 107 |
| P.s.t. DC3000 ΔhopQ1-1 | KBM Rifampicyna (100 ug/ml) | 100-krotne rozcieńczenie z 0.1 | 1 x 106 |
| P. syringae pv. tabaci 11528R | KBM Rifampicyna (100 ug/ml) | 100-krotne rozcieńczenie z 0.1 | 1 x 106 |
Tabela 2:Warunki hodowli i poziomy inokulum zastosowane w analizie. Wartości O.D. i odpowiadające im poziomy C.F.U. mogą się różnić w zależności od marki spektrofotometru.
Dyskusja
Test oparty na śmierci komórek może być wykorzystany do określenia zaangażowania genu w PTI. Na przykład za pomocą tego testu można badać mutanty z utratą funkcji badanego genu. Z 4 kombinacji inokulacji induktora i wyzwania podanych w Tabeli 1, możliwe jest, że tylko jedna kombinacja wywoła fenotyp w danym tle genetycznym rośliny. Zaobserwowaliśmy, że rośliny z wyciszonym genem FLS2 wykazują upośledzenie PTI w kombinacjach inokulacji induktora i wyzwania Pf/DC oraz Pf/Q1-1 (Tabela 1).
Kluczowe jest, aby warunki środowiskowe dla analizy były jak najbliższe tym opisanym w Części 3.1. Niska wilgotność powoduje zbyt szybki przebieg śmierci komórek, co utrudnia ocenę analizy. Jeśli warunki opisane w naszym protokole nie sprawdzą się w Twoim laboratorium, spróbuj zmienić poziom induktora lub dawkę inokulacji wyzywającej. Innym parametrem, który można zmodyfikować, jest odstęp czasowy między indukcją a wyzwaniem, choć stwierdziliśmy, że krótsze odstępy czasowe powodowały zbyt szybki rozpad analizy w roślinach kontrolnych.
Zalecamy, aby w eksperymencie przebadać co najmniej 4-5 roślin, a pozytywny fenotyp powinien zostać powtórzony w co najmniej 3-4 niezależnych eksperymentach.
Podziękowania
Dziękujemy Hye-Sook Oh, Joanne Morello i Alanowi Collmerowi z Katedry Patologii Roślin i Biologii Roślinno-Mikrobowej Uniwersytetu Cornell za cenne dyskusje. Dziękujemy Jesse'emu Munkvoldowi za uwagi do artykułu. Finansowanie zostało zapewnione przez National Science Foundation Plant Genome Program, numer grantu DBI-0605059 (GBM).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 1M, skorygować pH i wysterylizować przez filtr. Przechowywać w temperaturze pokojowej. |
| Spektrofotometr UV/Vis do nauk biologicznych | Beckman Coulter Inc. | DU 730 |
Bibliografia
- Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).
- Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).
- Oh, H. S., Collmer, A. Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins. Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).
- Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana. Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).
Przedruki i uprawnienia
