Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie mysich fibroblastów embrionalnych za pomocą czterech czynników transkrypcyjnych, systemu transdukcji lentiwirusowej indukowanej doksycykliną

Summary

Zestaw Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus może przeprogramować mysie fibroblasty embrionalne (MEF) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS). Tutaj demonstrujemy protokół indukowanej przez DOX ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych przeprogramowujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc w celu wygenerowania kolonii iPS, które wyrażają wspólne markery pluripotencji mES.

Abstract

Korzystając ze zdefiniowanego zestawu czynników transkrypcyjnych i warunków hodowli komórek, Yamanaka i współpracownicy wykazali, że dostarczanie i ekspresja Oct4, Sox2, c-Myc i Klf4 za pośrednictwem retrowirusa jest zdolna do indukowania pluripotencji w fibroblastach myszy. ¹ Kolejne doniesienia wykazały przydatność indukowanego doksycykliną (DOX) systemu dostarczania lentiwirusa do generowania zarówno pierwotnych, jak i wtórnych komórek iPS z wielu innych typów komórek somatycznych dorosłych myszy. ^2,3

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) są podobne do embrionalnych komórek macierzystych (ES) pod względem morfologii, proliferacji i zdolności do indukowania powstawania potworniaków. Oba typy komórek mogą być wykorzystywane jako pluripotencjalny materiał wyjściowy do wytwarzania zróżnicowanych komórek lub tkanek w medycynie regeneracyjnej. ^4-6 komórek iPS ma również wyraźną przewagę nad komórkami ES, ponieważ wykazują kluczowe właściwości komórek ES bez etycznego dylematu zniszczenia zarodka.

Tutaj demonstrujemy protokół przeprogramowania komórek mysich embrionalnych fibroblastów (MEF) za pomocą zestawu Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. Wykazaliśmy również, że zestaw lentiwirusów TF indukowanych przez mysz Stemgent DOX jest zdolny do ekspresji każdego z czterech czynników transkrypcyjnych po transdukcji do MEF, indukując w ten sposób pluripotencjalny stan komórek macierzystych, który wykazuje markery pluripotencji charakterystyczne dla komórek ES.

Protocol

1. Transdukcja wirusowa MEF

1. Dzień przed rozpoczęciem eksperymentu pokryj 15-centymetrowe naczynie do hodowli komórkowych sterylnie 0,2% żelatyny przefiltrowanej w ddH₂O. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
2. Odessać płyn z naczynia pokrytego żelatyną i zasiać komórki MEF (użyliśmy komórek MEF Nanog-GFP / rtTA) o gęstości 4x10⁵ komórek na naczynie. Inkubować komórki w 30 ml pożywki wzrostowej MEF (450 ml DMEM uzupełnionego 50 ml FBS, 5 ml 100x aminokwasów endogennych, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 200 mM L-glutaminy i 0,5 ml 55 mM β-merkaptoetanolu) przez dwa dni w temperaturze 37°C i 5% CO₂ do około 80% zlewania się.
3. Odessać pożywkę i dodać 30 ml pożywki wzrostowej MEF uzupełnionej skoncentrowanym lentiwirusem (4 x 100 μl roztworu podstawowego wirusa + 29,6 ml pożywki wzrostowej). Delikatnie kołysz naczyniem, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie podłoża. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO_{2 .}

2. Przeprogramowanie wywołane doksycykliną

1. 20-24 godziny po transdukcji trypsynizuj transdukowane komórki, odwiruj przy 200 x g przez 5 minut i ponownie zawieś w pożywce wzrostowej ES / iPS (450 ml Knockout DMEM uzupełnione 50 ml surowicy cielęcej z kwalifikacją komórek ES, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 0,5 ml β-merkaptoetanolu i 25 μl LIF). Nasiona transdukowały MEF w odpowiednim stężeniu dla wielkości płytki do hodowli komórkowej (użyliśmy 2,5 x 10⁵ komórek na 10 cm do eksperymentów z wydajnością przeprogramowania i izolacji kolonii oraz 2 x 10⁴ komórek na studzienkę na płytkach 4-dołkowych do eksperymentów ICC). Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂ . Uwaga: wszelkie pozostałe transdukowane komórki można zamrozić w ciekłym azocie do przyszłej analizy.
2. Odessać pożywkę i zastąpić pożywką ES/iPS przygotowaną na świeżo i uzupełnioną doksycykliną do końcowego stężenia 2 μg/ml (dodaliśmy również pożywkę bez DOX jako kontrolę ujemną). Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .

3. Immunocytochemiczna analiza skuteczności transdukcji

48 godzin po indukcji doksycykliny, określ skuteczność transdukcji za pomocą immunohistochemii (ICC). Przeprowadzić testy ICC na komórkach ponownie platerowanych na płytkach 4-dołkowych. Wszystkie objętości wymienione w poniższym protokole należy dostosować do rozmiaru płytki do hodowli komórkowej.

1. Delikatnie przemyj komórki raz PBS (bez Mg²⁺+ lub Ca²⁺).
2. Utrwalić komórki za pomocą 500 μl 0,5 ml 4% paraformaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
3. Delikatnie umyj komórki dwa razy za pomocą PBS.
4. Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 500 μl lodowatego 0,2% Tween-20® w PBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Delikatnie umyj komórki dwa razy za pomocą PBS.
6. Zablokuj niespecyficzne wiązanie za pomocą buforu blokującego o pojemności 200 μl przez godzinę w temperaturze pokojowej.
7. Inkubować komórki z 200 μl specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4°C (użyliśmy Oct4, Klf4, Sox2 i c-Myc).
8. Delikatnie umyj komórki dwa razy za pomocą PBS.
9. Inkubować komórki z 200 μl przeciwciała drugorzędowego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc płytki przed światłem (użyliśmy koniugatu Donkey anty-Rabbit Rhodamine, Donkey anty-Goat AlexaFluor® 594, Donkey anty-Mouse Rhodamine conjugate i Donkey anti-Rabbit Rhodamine conjugate).
10. Delikatnie umyj komórki dwa razy za pomocą PBS.
11. Dodać DAPI (stężenie końcowe 2 μg/ml w PBS) i inkubować przez 10 minut, aby uwidocznić jądra.
12. Delikatnie umyj komórki PBS.
13. Dodaj anti-fade Aqua-Mount przed obrazowaniem za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

4. Izolowanie i rozszerzanie kolonii komórek iPS

1. Po rozpoczęciu procesu przeprogramowania (zgodnie z opisem w sekcji 2) należy monitorować kultury i wymieniać pożywkę co 48 godzin. Użyliśmy pożywki zawierającej doksycyklinę do hodowli komórek przez pierwsze dwanaście dni, a następnie usunęliśmy doksycyklinę z pożywki, aby upewnić się, że kolonie iPS ręcznie wybrane do ekspansji będą niezależne od DOX.
2. Komórki powinny być codziennie monitorowane pod kątem zmian morfologicznych wskazujących na proces przeprogramowywania; lub w przypadku korzystania z komórek takich jak Nanog-GFP/rtTA MEF, monitorować morfologię i fluorescencję GFP w celu identyfikacji przeprogramowanych kolonii. Każdy eksperyment będzie inny, ale kolonie są na ogół wystarczająco duże, aby można je było izolować od 16 do 22 dni. Kolonie zidentyfikowane w tym czasie można następnie ręcznie wyizolować i wytrypsynizować w celu ekspansji i analizy.
3. Dzień przed izolacją i trypsynizacją przeprogramowanych kolonii należy przygotować 24-dołkową płytkę, wysiewając napromieniowaną promieniami gamma warstwę zasilającą MEF o gęstości 5 x 10⁴ komórek na dołek. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂ .
4. Ręcznie wybierz każdą kolonię iPS i trypsynizuj, aby zdysocjować agregaty komórek. Ponownie pokryć komórki iPS w pożywce ES/iPS w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki wstępnie obsianej napromieniowanymi promieniami gamma warstwami MEF. Studzienki powinny być wysiewane w gęstości 2 x 10⁵ komórek/studzienkę. Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO₂ . Zmieniaj nośniki co 24 godziny.
5. Codziennie monitoruj kolonie iPS pod kątem wzrostu i fluorescencji GFP. Wysiadujemy nasze kultury przez 6 dni przed pasażem.
6. Określ, które studzienki na płytce 24-dołkowej jednolicie wyrażają GFP. Studzienki, które mają dobrą ekspresję GFP, można trypsynizować i pasażować w stosunku 1:8 do płytek 4-dołkowych, które zostały wstępnie zasiane napromieniowanymi promieniami gamma warstwami zasilającymi MEF. Płytki te mogą być używane do analizy markerów pluripotencjalnych za pomocą barwienia ICC i AP.

5. Analiza immunocytochemiczna dla pluripotencji

Nasze testy ICC zostały przeprowadzone na komórkach rozprężonych w płytkach 4-dołkowych. Wszystkie objętości wymienione w poniższym protokole należy dostosować do rozmiaru płytki do hodowli komórkowej.

1. Delikatnie przemyć komórki dwukrotnie PBS (bez Mg²⁺+ lub Ca²⁺).
2. Inkubować w 0,5 ml lodowatego 0,2 % Tween 20 w PBS na studzienkę przez 10 minut.
3. Delikatnie umyj komórki trzy razy za pomocą PBS.
4. Zablokuj niespecyficzne wiązanie za pomocą buforu blokującego o pojemności 200 μl przez godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Inkubować komórki z 200 μl specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4°C (użyliśmy SSEA-1, Nanog i Oct4).
6. Delikatnie umyj komórki dwa razy za pomocą PBS.
7. Inkubować komórki z 200 μl przeciwciała drugorzędowego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, trzymając z dala od światła (użyliśmy koniugatu Donkey anty-Mouse Rhodamine i Donkey anti-Rabbit Rhodamine conjugate).
8. Delikatnie umyj komórki dwa razy za pomocą PBS.
9. Dodać DAPI (stężenie końcowe 2 μg/ml w PBS) i inkubować przez 10 minut, aby uwidocznić jądra.
10. Delikatnie umyj komórki za pomocą PBS
11. Dodaj anti-fade Aqua-Mount przed obrazowaniem za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

6. Barwienie kolonii komórek iPS za pomocą fosfatazy alkalicznej (AP)

1. Kolonie iPS z sekcji 4 można również analizować pod kątem aktywności AP przy użyciu dostępnych na rynku zestawów i zgodnie z protokołem producenta.

Część 7. Reprezentatywne wyniki

Zestaw Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus może być używany do przeprogramowania MEFów na komórki iPS. Po transdukcji MEF ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc można wykryć w komórkach traktowanych doksycykliną (DOX +), ale w komórkach nieleczonych (DOX-) można wykryć niewielką ekspresję lub nie ma jej wcale (ryc. 1). Zmiany morfologiczne będą postępować w czasie (w tym przykładzie 12 dni leczenia DOX), aby wygenerować większe, bardziej podobne do komórek ES kolonie z określonymi krawędziami kolonii i trójwymiarowym wzrostem (ryc. 2a). Po usunięciu DOX następuje zauważalne odwrócenie morfologii komórkowej dla niektórych kolonii podobnych do komórek ES, jednak wiele kolonii zachowało morfologię iPS (ryc. 2a). Te kolonie iPS, po wybraniu i pasażowaniu, wykazują typową ekspresję markera pluripotencji fosfatazy alkalicznej (AP), Nanog, Oct4 i SSEA-1 (ryc. 3). Typ komórek MEF użytych w tym eksperymencie (komórki MEF Nanog-GFP/rtTA) eksprymuje GFP z endogennego locus Nanog po przeprogramowaniu do stanu pluripotencji. Wyrażenie GFP może być zatem wykorzystane jako wstępny wskaźnik udanego przeprogramowania (rysunek 3).

Rysunek 1: Analiza immunocytochemiczna (ICC) 48 godzin po indukcji DOX. Skrajny lewy panel (-DOX) jest reprezentatywną kontrolą ujemną dla ekspresji czterech czynników transdukcji bez indukcji DOX. Prawidłowo wyrażone czynniki transkrypcyjne zostały potwierdzone przez odpowiednie przeciwciała (pokazane na czerwono), wybarwione DAPI w celu uwidocznienia jądra.

Rysunek 2: Morfologiczna konwersja MEFów Nanog-GFP/rtTA do stanu komórki iPS. A) 100-krotne obrazowanie z kontrastem fazowym komórek, wykazujące zagęszczenie i przekształcenie MEF w kolonie iPS w czasie od 3 dnia (D3 + Dox) do 22 dnia (D22). DOX został wycofany w dniu 12. Lewy górny panel: 20-krotny obraz kontroli negatywnej z płytki –DOK. B) 200-krotne obrazy kontrastu fazowego i fluorescencji GFP podświetlonej kolonii iPS po indukcji DOX w dniu 18. C) 200-krotne obrazy kontrastu fazowego i fluorescencji GFP dodatkowej kolonii iPS po indukcji DOX w 18 dniu.

Rysunek 3: Analiza kolonii iPS. (A) Mikroskopia z kontrastem fazowym i barwienie AP kolonii iPS (200x). (B) Analiza markerów pluripotencji: Lewy panel pokazuje nakładkę kontrastu fazowego z wyrażeniem reportera przeprogramowującym GFP. Ekspresja GFP odzwierciedla endogenny poziom ekspresji Nanog. Środkowy panel pokazuje barwienie ICC dla markerów pluripotencji. Prawy panel pokazuje barwienie DAPI w celu wizualizacji jąder (100x).

Discussion

Wyniki te pokazują, że zestaw Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set może być używany do efektywnego generowania kolonii iPS poprzez indukowanie ektopowej ekspresji transdukowanych czynników transkrypcyjnych w mysich fibroblastach embrionalnych. Projektując eksperymenty przeprogramowywania, należy wziąć pod uwagę kilka zmiennych, aby zoptymalizować wydajność przeprogramowania. Po pierwsze, możliwa jest modyfikacja stosunku aktywnego wirusa do komórek docelowych (tj. M.O.I.) na etapie pierwotnej infekcji w celu zwiększenia lub zmniejszenia wydajności transdukcji, wpływając w ten sposób na liczbę zintegrowanych wirusów w populacji komórek docelowych. Po drugie, dostosowanie czasu, przez jaki komórki są wystawione na działanie DOX, może wpłynąć na wydajność wytwarzania kolonii komórek iPS. Po trzecie, zdolność proliferacyjna komórek docelowych może wpływać na przeprogramowanie, ponieważ komórki, które aktywnie rosną i dzielą się, są bardziej podatne na przeprogramowanie. Wreszcie, podczas modyfikowania protokołu dla różnych liczb komórek lub różnych rozmiarów naczyń do hodowli tkankowych, zaleca się, aby docelowa liczba komórek była dostosowana proporcjonalnie do powierzchni szalki hodowlanej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOX Indukowalna mysz TF Skoncentrowany zestaw lentifirus	Stemgent	00-0003