Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Podsumowanie

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Streszczenie

Wykorzystując określony zestaw czynników transkrypcyjnych oraz warunki hodowli komórkowej, Yamanaka i współpracownicy wykazali, że dostarczenie i ekspresja Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4 za pośrednictwem retrowirusów jest w stanie indukować pluripotencję w fibroblastach mysich.¹ W późniejszych doniesieniach wykazano użyteczność indukowalnego doksycykliną (DOX) systemu dostarczania lentiwirusowego w celu generowania pierwotnych i wtórnych komórek iPS z różnych innych typów dorosłych somatycznych komórek mysich.^2,3

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) są podobne do embrionalnych komórek macierzystych (ES) pod względem morfologii, proliferacji oraz zdolności do indukowania tworzenia potworniaków. Oba typy komórek mogą służyć jako pluripotencjalny materiał wyjściowy do generowania zróżnicowanych komórek lub tkanek w medycynie regeneracyjnej.^4-6 Komórki iPS mają również wyraźną przewagę nad komórkami ES, ponieważ wykazują kluczowe właściwości komórek ES, nie budząc przy tym dylematów etycznych związanych z niszczeniem embrionów.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przeprogramowania embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) przy użyciu zestawu lentiwirusowych wektorów Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. Wykazujemy również, że zestaw Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set umożliwia ekspresję każdego z czterech czynników transkrypcyjnych po transdukcji do komórek MEF, indukując tym samym stan pluripotencjalnych komórek macierzystych wykazujących markery pluripotencji charakterystyczne dla komórek ES.

Protokół

1. Transdukcja wirusowa MEF-ów

1. Dzień przed rozpoczęciem eksperymentu pokryć 15 cm szalkę do hodowli komórkowej 0,2% żelatyną filtrowaną sterylnie w ddH₂O. Inkubować szalkę przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
2. Odssać ciecz z pokrytej żelatyną szalki i zasiać komórki MEF (użyto komórek Nanog-GFP/rtTA MEF) w gęstości 4x10⁵ komórek na szalkę. Inkubować komórki w 30 ml pożywki wzrostowej MEF (450 ml DMEM uzupełnionej o 50 ml FBS, 5 ml 100x nieistotnych aminokwasów, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 200 mM L-glutaminy i 0,5 ml 55 mM β-merkaptoetanolu) przez dwa dni w temperaturze 37°C i 5% CO₂, aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 80%.
3. Odssać pożywkę i dodać 30 ml pożywki wzrostowej MEF uzupełnionej o skoncentrowany lentiwirus (4 x 100 μl roztworu zapasu wirusa + 29,6 ml pożywki wzrostowej). Delikatnie kołysać szalką, aby zapewnić równomierne rozłożenie pożywki. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂.

2. Reprogramowanie indukowane doksycykliną

1. Od 20 do 24 godzin po transdukcji poddać przetransdukowane komórki trypsynizacji, odwirować z prędkością 200 x g przez 5 minut i resuspendować w pożywce wzrostowej ES/iPS (450 ml Knockout DMEM uzupełnionej o 50 ml kwalifikowanego serum cielęcego do hodowli komórek ES, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 0,5 ml β-merkaptoetanolu oraz 25 μl LIF). Wysiać przetransdukowane MEF w stężeniu odpowiednim do rozmiaru naczynia hodowlanego (w eksperymentach dotyczących wydajności reprogramowania i izolacji kolonii zastosowano 2,5 x 10⁵ komórek na szalkę 10 cm, a w eksperymentach ICC 2 x 10⁴ komórek na dołek w płytkach 4-dołkowych). Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂. Uwaga: pozostałe przetransdukowane komórki można zamrozić w ciekłym azocie do późniejszych analiz.
2. Odssać pożywkę i zastąpić ją świeżo przygotowaną pożywką ES/iPS uzupełnioną doksycykliną do stężenia końcowego 2 μg/ml (jako kontrolę negatywną zastosowano również pożywkę bez DOX). Inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO₂.

3. Analiza immunocytochemiczna wydajności transdukcji

48 godzin po indukcji doksycykliną należy określić wydajność transdukcji za pomocą immunohistochemii (ICC). Badanie ICC należy przeprowadzić na komórkach przesianych do płytek 4-dołkowych. Wszystkie objętości wymienione w poniższym protokole powinny zostać dostosowane do rozmiaru płytki hodowlanej.

1. Przemyj delikatnie komórki raz za pomocą PBS (bez Mg²⁺+ lub Ca²⁺+).
2. Utrwal komórki, dodając 500 μl 0,5 ml 4% paraformaldehydu w PBS, i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
3. Przemyj delikatnie komórki dwa razy za pomocą PBS.
4. Przeprowadź permeabilizację komórek, dodając 500 μl schłodzonego do temperatury lodowej 0,2% Tween®-20 w PBS. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przemyj delikatnie komórki dwa razy za pomocą PBS.
6. Zablokuj niespecyficzne wiązania, dodając 200 μl buforu blokującego, i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
7. Inkubuj komórki z 200 μl specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4°C (użyto przeciwciał przeciwko Oct4, Klf4, Sox2 i c-Myc).
8. Przemyj delikatnie komórki dwa razy za pomocą PBS.
9. Inkubuj komórki z 200 μl przeciwciała wtórnego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc płytki przed światłem (użyto koniugatów: Donkey anti-Rabbit Rhodamine, Donkey anti-Goat AlexaFluor® 594, Donkey anti-Mouse Rhodamine oraz Donkey anti-Rabbit Rhodamine).
10. Przemyj delikatnie komórki dwa razy za pomocą PBS.
11. Dodaj DAPI (stężenie końcowe 2 μg/ml w PBS) i inkubuj przez 10 minut w celu wizualizacji jąder komórkowych.
12. Przemyj delikatnie komórki za pomocą PBS.
13. Przed obrazowaniem przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego dodaj medium antyblaknące Aqua-Mount.

4. Izolowanie i powiększanie kolonii komórek iPS

1. Po zainicjowaniu procesu przeprogramowania (opisanego w sekcji 2), monitoruj hodowle i wymieniaj medium co 48 godzin. Przez pierwsze dwanaście dni do hodowli komórek stosowaliśmy medium zawierające doksycyklinę, a następnie usunęliśmy doksycyklinę z medium, aby zapewnić, że kolonie iPS ręcznie wybrane do ekspansji będą niezależne od DOX.
2. Komórki należy monitorować codziennie pod kątem zmian morfologicznych wskazujących na proces przeprogramowania; w przypadku użycia komórek takich jak Nanog-GFP/rtTA MEF, monitoruj morfologię i fluorescencję GFP w celu zidentyfikowania przeprogramowanych kolonii. Każdy eksperyment będzie przebiegać inaczej, ale kolonie są zazwyczaj wystarczająco duże do izolacji między 16. a 22. dniem. Kolonie zidentyfikowane w tym przedziale czasowym można następnie izolować ręcznie i trypsynizować w celu ekspansji i analizy.
3. Dzień przed izolacją i trypsynizacją przeprogramowanych kolonii, przygotuj płytkę 24-dołkową, wysiewając gamma-naświetlone MEF warstwy karmionki w gęstości 5 x 10⁴ komórek na dołek. Inkubuj przez noc w 37°C i 5% CO₂.
4. Ręcznie wybierz każdą kolonię iPS i poddaj trypsynizacji, aby rozbić agregaty komórkowe. Przesiej komórki iPS w medium ES/iPS do poszczególnych dołków płytki 24-dołkowej uprzednio wysianej gamma-naświetlonymi MEF warstwami karmionki. Dołki powinny być wysiewane w gęstości 2 x 10⁵ komórek/dołek. Inkubuj w 37°C i 5% CO₂. Wymieniaj media co 24 godziny.
5. Codziennie monitoruj wzrost kolonii iPS oraz fluorescencję GFP. Hodowle inkubujemy przez 6 dni przed pasażowaniem.
6. Ustal, które dołki płytki 24-dołkowej wykazują jednorodną ekspresję GFP. Dołki z dobrą ekspresją GFP można trypsynizować i pasażować w stosunku 1:8 na płytki 4-dołkowe, które zostały uprzednio wysiane gamma-naświetlonymi MEF warstwami karmionki. Płytki te można wykorzystać do analizy markerów pluripotencji za pomocą ICC i barwienia AP.

5. Analiza immunocytochemiczna w kierunku pluripotencji

Badania ICC przeprowadzono na komórkach namnożonych na płytkach 4-dołkowych. Wszystkie objętości wymienione w poniższym protokole należy dostosować do rozmiaru płytki do hodowli komórkowej.

1. Przemyj delikatnie komórki dwukrotnie za pomocą PBS (bez Mg²⁺+ lub Ca²⁺).
2. Inkubuj przez 10 minut w 0,5 ml lodowatego 0,2 % Tween 20 w PBS na każdą studzinkę.
3. Przemyj delikatnie komórki trzykrotnie za pomocą PBS.
4. Zablokuj nieswoiste wiązania, dodając 200 μl buforu blokującego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
5. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 4°C z 200 μl specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego (użyliśmy SSEA-1, Nanog i Oct4).
6. Przemyj delikatnie komórki dwukrotnie za pomocą PBS.
7. Inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 200 μl przeciwciała drugorzędowego, chroniąc próbki przed światłem (użyliśmy koniugatu Donkey anti-Mouse Rhodamine oraz Donkey anti-Rabbit Rhodamine).
8. Przemyj delikatnie komórki dwukrotnie za pomocą PBS.
9. Dodaj DAPI (stężenie końcowe 2 μg/ml w PBS) i inkubuj przez 10 minut w celu wizualizacji jąder komórkowych.
10. Przemyj delikatnie komórki za pomocą PBS.
11. Przed obrazowaniem za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego dodaj środek antyblaknący Aqua-Mount.

6. Barwienie kolonii komórek iPS na fosfatazę alkaliczną (AP)

1. Kolonie iPS z sekcji 4 mogą być również analizowane pod kątem aktywności AP z wykorzystaniem dostępnych komercyjnie zestawów, zgodnie z protokołem producenta.

Część 7. Reprezentatywne wyniki

Zestaw lentiwirusów Stemgent DOX Inducible Mouse TF może być wykorzystany do przeprogramowania MEF w komórki iPS. Po transdukcji MEF ekspresja czynników transkrypcyjnych Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc może być wykryta w komórkach traktowanych doksycykliną (DOX+), natomiast w komórkach nietraktowanych (DOX-) ekspresja jest znikoma lub niewykrywalna (rycina 1). Zmiany morfologiczne będą postępować w czasie (w tym przykładzie 12 dni traktowania DOX), prowadząc do powstania większych kolonii bardziej przypominających komórki ES, z wyraźnymi krawędziami i wzrostem trójwymiarowym (rycina 2a). Po usunięciu DOX w niektórych koloniach przypominających komórki ES następuje zauważalny powrót do pierwotnej morfologii komórkowej, jednak wiele kolonii zachowuje morfologię iPS (rycina 2a). Kolonie iPS te, po wyizolowaniu i pasażowaniu, wykazują typową ekspresję markerów pluripotencji: fosfatazy alkalicznej (AP), Nanog, Oct4 i SSEA-1 (rycina 3). Typ komórek MEF użyty w tym doświadczeniu (komórki Nanog-GFP/rtTA MEF) wykazuje ekspresję GFP z endogennego locus Nanog po przeprogramowaniu do stanu pluripotencji. Ekspresja GFP może zatem służyć jako wstępny wskaźnik udanego przeprogramowania (rycina 3).

Rysunek 1: Analiza immunocytochemiczna (ICC) 48 godzin po indukcji DOX. Panel po lewej stronie (-DOX) stanowi reprezentatywną kontrolę negatywną dla ekspresji czterech czynników transdukcji bez indukcji DOX. Poprawną ekspresję czynników transkrypcyjnych potwierdzono za pomocą odpowiednich przeciwciał (zaznaczonych na czerwono), z barwieniem DAPI w celu wizualizacji jądra komórkowego.

Rysunek 2: Konwersja morfologiczna MEF Nanog-GFP/rtTA do stanu komórek iPS. A) Obrazowanie w kontraście fazowym (100x) komórek wykazujących zagęszczenie i konwersję MEF w kolonie iPS w czasie od dnia 3 (D3+Dox) do dnia 22 (D22). DOX wycofano w dniu 12. Panel górny lewy: obraz kontrolny ujemny (20x) z płytki –DOX. B) Obrazy w kontraście fazowym i fluorescencji GFP (200x) wyróżnionej kolonii iPS w 18. dniu po indukcji DOX. C) Obrazy w kontraście fazowym i fluorescencji GFP (200x) dodatkowej kolonii iPS w 18. dniu po indukcji DOX.

Rycina 3: Analiza kolonii iPS. (A) Mikroskopia w kontraście fazowym i barwienie AP kolonii iPS (200x). (B) Analiza markerów pluripotencji: panel lewy przedstawia nałożenie obrazu w kontraście fazowym na ekspresję reportera reprogramowania GFP. Ekspresja GFP odzwierciedla endogenny poziom ekspresji Nanog. Panel środkowy przedstawia barwienie ICC dla markerów pluripotencji. Panel prawy przedstawia barwienie DAPI w celu wizualizacji jąder (100x).

Dyskusja

Wyniki te wykazują, że zestaw Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set może być wykorzystany do wydajnego generowania kolonii iPS poprzez indukcję ektopowej ekspresji przetransdukowanych czynników transkrypcyjnych w embrionalnych fibroblastach mysich. Podczas projektowania eksperymentów z przeprogramowaniem należy wziąć pod uwagę kilka zmiennych w celu optymalizacji wydajności tego procesu. Po pierwsze, podczas etapu pierwotnej infekcji można zmodyfikować stosunek aktywnego wirusa do komórki docelowej (tj. M.O.I.), aby zwiększyć lub zmniejszyć wydajność transdukcji, co wpływa na liczbę zintegrowanych wirusów w populacji komórek docelowych. Po drugie, dostosowanie czasu ekspozycji komórek na DOX może wpłynąć na wydajność generowania kolonii komórek iPS. Po trzecie, zdolność proliferacyjna komórek docelowych może oddziaływać na przeprogramowanie, ponieważ komórki aktywnie rosnące i dzielące się są bardziej podatne na ten proces. Na koniec, przy modyfikowaniu protokołu dla różnej liczby komórek lub naczyń hodowlanych o różnej wielkości, zaleca się, aby liczba komórek docelowych była dostosowana proporcjonalnie do powierzchni naczynia hodowlanego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw skoncentrowanego lentiwirusa TF mysiego indukowanego DOX	Stemgent	00-0003