Ilościowa fosfoproteomika w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi

Podsumowanie

Opis ilościowej procedury fosforylacji z wykorzystaniem kriolizy, solubilizacji mocznikiem, frakcjonowania HILIC oraz wzbogacania peptydów fosforylowanych metodą IMAC.

Streszczenie

Niniejszy protokół opisuje hodowlę oraz stymulację kwasem tłuszczowym – oleinianem – komórek S. cerevisiae znakowanych izotopami ciężkimi i lekkimi. Komórki są rozcierane przy użyciu procedury kriolizy w młynku kulowym, a otrzymany materiał jest wprowadzany do roztworu poprzez solubilizację mocznikiem. Procedura ta umożliwia lizę komórek w stanie metabolicznie nieaktywnym, co pozwala na zachowanie stanu fosforylacji i zapobiega reorganizacji fosfoproteomu podczas lizy komórkowej. Po redukcji, alkilacji i trawieniu białek trypsyną, próbki są odsalane na kolumnach C18, a stopień ich złożoności jest ograniczany poprzez frakcjonowanie z wykorzystaniem chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC). Kolumny HILIC preferencyjnie zatrzymują cząsteczki hydrofilowe, co jest wysoce przydatne w fosfoproteomice. Peptydy fosforylowane mają tendencję do eluowania w późniejszym etapie profilu chromatograficznego niż ich niefosforylowane odpowiedniki. Po frakcjonowaniu fosfopeptydy są wzbogacane z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa do jonów metali, która opiera się na powinowactwie elektrostatycznym w celu wzbogacenia frakcji fosfopeptydów. Po zakończeniu tej procedury próbki są gotowe do analizy ilościowej metodą spektrometrii mas.

Protokół

Wzrost komórek i pożywki

1. Pojedynczą kolonię komórek BY4742Δarg4Δlys1 inkubowano przez noc w 100 mL pożywki bogatej do uzyskania OD₆₀₀ wynoszącej 1,0, a następnie zaszczepiono do dwóch 1-litrowych kultur minimalnego podłoża drożdżowego (0,17% Yeast Nitrogen Base bez siarczanu amonu lub aminokwasów, 0,5% siarczanu amonu) zawierającego pełny zestaw aminokwasów, uzupełnionego o 20mg/L izotopowo lekkiej lub ciężkiej argininy (¹³C₆ ¹⁵N₄; Isotec) oraz lizyny (¹³C₆ ¹⁵N₂; Isotec).
2. Komórki hodowano przez 18 godzin do uzyskania OD₆₀₀ wynoszącej 1,8. Kluczowe jest, aby komórki przeszły przez co najmniej 9 generacji w celu pełnej inkorporacji znakowanych izotopów. Próbkę lekką odwirowano, przemyto sterylną wodą, ponownie zaszczepiono do pożywki zawierającej oleinian (izotopowo lekka arginina i lizyna, 0,2% oleinianu (Sigma Chemicals) oraz 0,5% Tween 40 (Sigma Chemicals)) i stymulowano przez kolejne 85 minut. W ten sposób otrzymano izotopowo lekką (pod względem argininy i lizyny) próbkę stymulowaną oleinianem oraz izotopowo ciężką próbkę referencyjną hodowaną na glukozie.

Lizą komórek, izolacja i frakcjonowanie peptydów

3. Zważyć butelkę do wirowania. Zebrać próbki poprzez wirowanie przez 3 minuty. Usunąć medium i odessać nadmiar cieczy. Zważyć osad wraz z butelką (zazwyczaj uzyskamy od 1-2 gramów), a następnie gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie. Dodać do zamrożonych osadów w ciekłym azocie objętość buforu do rozcierania równą masie osadu (fosforanowy bufor solny (PBS, Gibco), 10% glicerol, inhibitory proteaz (SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets, Sigma) oraz inhibitory fosfataz HALT (Thermo Scientific)).
4. Zamrozić naczynie do rozcierania w ciekłym azocie. Odczekać, aż ciekły azot przestanie wrzeć. Przenieść osad do naczynia do rozcierania wraz z zamrożonymi kulkami mielącymi.
5. Rozcierać przy 600 rpm w cyklach 1 min 20 s z odwróceniem kierunku przez 3 minuty. Ponownie zamrozić naczynie do rozcierania w ciekłym azocie. Powtórzyć czynność jeszcze 4 razy, tak aby całkowity czas rozcierania wyniósł 15 minut.
6. Zebrać zamrożony materiał rozcierany do probówki Falcon 50 ml i umieścić na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
7. Przygotować 10 ml roztworu 8M mocznika, 0,1M wodorowęglanu amonu, 0,1M Tris pH 8,6. Dodać 3 objętości buforu mocznikowego do 1 objętości zamrożonego materiału rozcieranego (na przykład 3 ml buforu mocznikowego dodać do 1 grama osadu z 1 ml buforu PBS). Natychmiast poddać mieszaninę sonikacji za pomocą sonikatora z sondą (pulsy 2-10 sekundowe). Trzymać końcówkę sondy blisko dna probówki, aby zapobiec pienieniu się roztworu. Materiał rozcierany powinien natychmiast przejść do roztworu.
8. Oczyścić lizat poprzez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 4°C.
9. Przenieść nadsącz do nowych probówek.
10. Przygotować świeżą alikwot 0,5M fosfiny [2-karboksyetylowej] (TCEP) w Tris. Dodać do próbki w stosunku 1:100, aby uzyskać stężenie końcowe 5mM. Inkubować w 37°C przez 1 h.
11. Alkilowanie zredukowanych cystein. Pozostawić do ochłodzenia do temperatury pokojowej. Przygotować świeżą alikwot 1M jodoacetamidu. Przechowywać w ciemności (owijamy probówkę folią). Dodać do stężenia końcowego 20mM. Inkubować w ciemności przez 1 h w temperaturze pokojowej.
12. Zneutralizować jodoacetamid za pomocą 20mM DTT z roztworu stokowego 1M w temperaturze pokojowej przez 1 h.
13. Oznaczyć ilość białka za pomocą standardowego testu Bradforda lub BCA (nieopisanego). Pobrać próbkę do analizy metodą SDS PAGE poniżej.
14. Aby zweryfikować wbudowanie ciężkich izotopów, użyć 100 μl zredukowanego i alkilowanego lizatu. Rozcieńczyć 1:4 w dH₂O, poddać sonikacji i dodać trypsynę w stosunku białko do trypsyny 50:1. Trawić przez minimum 4 godziny, wysuszyć próbkę w wirówce odparowującej (speed vac), a następnie odsolić za pomocą kolumienek C18 Ultramicrospin (The Nest Group).
    1. Nawodnić kolumienkę 100 μl acetonitrylu.
    2. Zrównoważyć 200 μl 0,1% TFA.
    3. Resuspendować wysuszoną próbkę w 200 μl 0,1% TFA. Nałożyć na kolumienkę. Wirować przy ~200 x g lub minimalnej prędkości wymaganej do przepływu przez kolumienkę.
    4. Przemyć dwukrotnie 200 μl 0,1% TFA.
    5. Eluować dwukrotnie 50 μl 60% acetonitrylu, 0,1% TFA.
    6. Wysuszyć próbkę w wirówce odparowującej.
    7. Resuspendować próbkę w 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Nałożyć 2 μl na spektrometr mas. Sprawdzić wbudowanie izotopowo ciężkiej argininy i lizyny poprzez przesunięcie o 10 i 8 Daltonów w odpowiednich widmach m/z. Wbudowanie dla każdego aminokwasu powinno wynosić od 96 do 98%.
15. Zmieszać równoważne ilości (mg białek) próbek izotopowo ciężkich i lekkich.
16. Rozcieńczyć próbkę 1:4 w 20% metanolu.
17. Dodać trypsynę w stosunku 1:200. Inkubować przez noc w 37°C.
18. Sprawdzić kompletność trawienia za pomocą SDS PAGE. Nałożyć 2 i 4 μl próbki przed trawieniem oraz 8 i 16 μl po trawieniu trypsyną. Zwizualizować za pomocą barwienia Coomassie, czy trawienie zostało zakończone. Jeśli nie jest kompletne, krótko poddać próbkę sonikacji za pomocą sonikatora z sondą i ponownie trawić trypsyną.
19. Wysuszyć próbkę w wirówce odparowującej. Po wysuszeniu dodać 200 μl przefiltrowanej dH₂O i mieszać w wirówce do całkowitego rozpuszczenia osadu. Ponownie wysuszyć próbkę w wirówce odparowującej. Ponownie resuspendować w dH₂O. Ponownie wysuszyć próbkę.
20. Resuspendować osad w 0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA; Sigma). Sprawdzić za pomocą pasków pH, czy pH wynosi około 3. W razie potrzeby zakwasić 10% TFA.
21. Odwirować ewentualny osad.
22. Odsolić próbki na kolumience Waters Sep-Pak Vac 500 mg C18. Nie przeciążać tych kolumienek. Maksymalna ilość to 5 mg, lecz lepiej nałożyć nieco mniej. W razie potrzeby podzielić próbkę na kilka kolumienek.
    1. Nawodnić kolumienkę 5 ml 100% acetonitrylu. Wirować przy ~200 x g lub minimalnej prędkości wymaganej do przepływu przez kolumienkę.
    2. Zrównoważyć kolumienkę 5 ml 0,1% TFA. Nałożyć próbkę. Zebrać przesącz i nałożyć ponownie.
    3. Przemyć 5 ml 0,1% TFA. Powtórzyć.
    4. Eluować 2 ml 60% acetonitrylu, 0,1% TFA.
    5. Wysuszyć próbkę w wirówce odparowującej.

Frakcjonowanie peptydów i izolacja fosfopeptydów

1. Peptydy są frakcjonowane na kolumnie HILIC. Używamy kolumny analitycznej TOSOH TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm z kolumną guardingową. Należy poświęcić odpowiednią ilość czasu na ten etap: kolumnę płucze się przez 2 godziny przy 90% A, a następnie przeprowadza dwa puste gradienty przed załadowaniem próbki. Przyjmuje się, że maksymalna ładowność kolumny o tej wielkości wynosi około XX; zazwyczaj nie ładujemy więcej niż 5 mg na jeden rozdział.
2. Rozpuszczalnik A – 98% ACN/0,1% TFA
   Rozpuszczalnik B – 2% ACN/0,1% TFA
   Załadunek w 90% A przez 20', przejście z 90% A do 85% A przez 5', z 85% A do 60% A przez 40', z 60% A do 0% A przez 5', z 0% A do 90% A przez 5'.
3. Prędkość przepływu wynosi 1ml/min, a frakcje są zbierane w odstępach 2-minutowych, zaczynając od gradientu od 85% A do 60% A.
4. Łączy się frakcje, aby zredukować ich liczbę do 10. Większa liczba frakcji prawdopodobnie zapewni szerszy zakres pokrycia fosfoproteomu.

Wzbogacanie fosfopeptydów

1. Fosfopeptydy są wzbogacane przy użyciu żelu PHOS-Select Iron Affinity. Żywicę IMAC rozdzielamy na alikwoty, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Należy przygotować 50 ml roztworu ładunkowego składającego się z 250 mM kwasu octowego i 30% ACN. pH należy dostosować do wartości 2,7 za pomocą HCl. Osady resuspensuje się w 500 μl roztworu ładunkowego. Należy sprawdzić pH i w razie potrzeby skorygować je za pomocą HCl lub NaOH.
2. W odpowiedniej kolumnie należy wstępnie przemyć 200 μl kulek IMAC. Stosujemy kolumny wirowkowe Molbiotec.
   Do każdej frakcji dodaje się 15 μl 50% zawiesiny (żel w roztworze ładunkowym) i inkubuje próbki przez 30' w rotatorze typu end-over-end. Przechowuje się przepływ do analizy.
3. Próbki przemywa się 3 razy roztworem ładunkowym i raz 500 μl filtrowanej dH₂O.
4. Peptydy elui się przez 2-3 min przy użyciu 400 μl buforu 50 mM Na₂HPO₄ (pH 8,4). Eluat przenosi się do szklanej fiolki.
5. Roztwór zakwasza się do pH 3 za pomocą 5 μl 100% kwasu mrówkowego, zamraża szokowo w ciekłym azocie, a następnie osusza próbkę w wirówce próżniowej (speed vac).
6. Fosfopeptydy resuspensuje się w 200 μl 0,1% TFA i oczyszcza na kolumnie C18 zgodnie z opisem powyżej. Eluowane próbki osusza się w wirówce próżniowej.
7. Peptydy resuspensuje się w 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Do analizy spektrometrem mas stosuje się 2 μl lub taką ilość, jaka jest wymagana.

Uwagi

W znacznej części niniejszego protokołu praca odbywa się „na ślepo”. Lizę komórek można monitorować za pomocą western blottingu oraz testów Bradforda lub BCA, a trawienie trypsyną można również łatwo ocenić. Kolumna HILIC wygeneruje ślad podobny do przedstawionego tutaj lub do tych opisanych przez innych autorów [1, 2], w zależności od użytego urządzenia do chromatografii cieczowej. Próbki są monitorowane za pomocą spektrometrii mas; przed przeprowadzeniem kosztownych analiz na urządzeniu o wysokiej rozdzielczości i wysokiej dokładności masy, należy przetestować próbki na tańszych urządzeniach, takich jak LCQ lub MALDI. Na koniec, jeśli odparowuje się próbkę zawierającą kwas, należy użyć szkła.

Dyskusja

Metoda ta pozwoli na wzbogacenie frakcji fosfopeptydów, które można poddać analizie ilościowej. W niniejszym protokole można zmienić szereg parametrów, jednak najważniejszą kwestią jest zachowanie stanu fosforylacji. Przygotowanie komórek do analizy ilościowej można przeprowadzić na kilka różnych sposobów; na przykład w przypadku braku możliwości znakowania komórek in vivo, po ekstrakcji można zastosować tagi takie jak ICAT[3] lub ITRAC [4], aby różnicowo oznakować dwie hodowle na potrzeby analizy ilościowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Isotec™ L-arginina-13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-lizyna-15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ roztwór fosforanowo-buforowany (PBS) 7,4 (10X)	Invitrogen	70011044
Tabletki z inhibitorem proteaz SigmaFAST	Sigma-Aldrich	S8820
Koktajl inhibitorów fosfataz Pierce Halt	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
Młyn kulowy Retsch PM100	Retsch	20.540.0001
Stalowy naczynie mielące Retsch 125 ml	Retsch	01.462.0148
kolumna Ultramicrospin C18	Grupa Nest	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
kolumna analityczna TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm	Tosoh Corp.	13071	Jest to kolumna chromatograficzna HILIC.
Kolumna ochronna 4,6 mm ID x 1 cm	Tosoh Corp.	19021	Zalecamy stosowanie tej kolumny ochronnej w celu przedłużenia żywotności kolumny HILIC.
PHOS-Select™ Żel powinowactwa do żelaza	Sigma-Aldrich	P9740	Oto żywica IMAC. Należy ją podzielić na aalikwoty i przechowywać.