W niniejszym filmie zaprezentowano sposób pomiaru inwazji komórek przez wkładki do hodowli komórkowych z wykorzystaniem metody fluorescencyjnej.
Artykuł metodologiczny
Test inwazyjności guza FluoroBlok In vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Cechą charakterystyczną komórek przerzutowych jest ich zdolność do naciekania przez błonę podstawną i migrowania do innych części ciała. Aby komórki mogły być inwazyjne, muszą być zdolne zarówno do wydzielania proteaz rozkładających błonę podstawną, jak i do migracji. System BD BioCoat Tumor Invasion System zapewnia komórkom warunki umożliwiające ocenę ich właściwości inwazyjnych.in vitro1,2Składa się z płytki wkładkowej BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell z membraną PET o rozmiarze porów 8,0 mikrona, która została równomiernie pokryta BD Matrigel Matrix. Ta jednolita warstwa BD Matrigel Matrix służy jako zrekonstytuowana błona podstawnain vitro tworząc rzeczywistą barierę dla komórek nieinwazyjnych, jednocześnie prezentując odpowiednią strukturę białkową do badania inwazji. Proces powlekania zamyka pory membrany, blokując migrację komórek nieinwazyjnych przez membranę. Z kolei komórki inwazyjne są w stanie oderwać się i migrować przez powleczoną membranę. Ilościowe określenie inwazji komórek można przeprowadzić poprzez znakowanie barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak DiIC, albo przed, albo po inwazji komórek12(3) lub odpowiednio calcein AM, i pomiar fluorescencji komórek naciekających. Ponieważ membrana BD FluoroBlok skutecznie blokuje przejście światła z zakresu 490-700 nm z wydajnością >99%, komórki znakowane fluorescencyjnie, które nie naciekły, nie są wykrywane przez czytnik płytek fluorescencyjnych z odczytem od dołu. Natomiast komórki, które naciekły na dolną stronę membrany, nie są już osłonięte przed źródłem światła i zostają wykryte przez odpowiedni czytnik płytek. W niniejszym filmie zaprezentowano końcowy test inwazyjności komórek z wykorzystaniem calcein AM do wykrywania komórek, które naciekły.
Protokół
Post-etykietowanie i pomiar z użyciem barwnika fluorescencyjnego BD calcein AM
Komórki są znakowane w celu ilościowego oznaczenia po tym, jak przejdą przez macierz BD Matrigel i membranę BD FluoroBlok. W konsekwencji możliwe jest uzyskanie jedynie pomiaru końcowego inwazji komórkowej.
- Hodować komórki do uzyskania ok. 80% konfluencji.
- Przygotować i rehydratyzować system wkładkowy.
- Wyjąć opakowanie z przechowywania w temperaturze -20°C i doprowadzić je do temperatury pokojowej.
- Otworzyć foliowe opakowanie i dodać 500 μL ciepłego (37°C) medium do wnętrza studni wkładkowych. Pozostawić płytkę do rehydratyzacji na 2 godziny w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2.
Uwaga: Nie ma potrzeby rehydratyzowania niepowlekanego systemu wkładkowego BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System, który będzie służył jako kontrola migracji komórek. - Po rehydratyzacji ostrożnie usunąć medium ze studni wkładkowych, nie naruszając warstwy BD Matrigel Matrix na membranie. System jest teraz gotowy do użycia.
- Przygotować zawiesiny komórkowe poprzez trypsynizację monowarstw komórkowych i resuspensję komórek w bezserowym DMEM w stężeniu 5 x 104 komórek/mL.
Uwaga: W przypadku użycia innego typu komórek należy wyznaczyć optymalną gęstość wysiewu. Aby wyznaczyć optymalną gęstość wysiewu dla danego typu komórek na porowatej powierzchni wzrostu, należy zastosować zakres gęstości wysiewu (komórek/cm2), który obejmuje gęstość wysiewu stosowaną na powierzchniach nieporowatych (np. w kolbach, naczyniach i płytkach). Na przykład, jeśli obecnie stosuje się wysiew w gęstości 2,5 x 105 komórek/cm2, należy wysiać komórki w różnych stężeniach między 5 x 104 a 5 x 105 komórek/cm2, aby wyznaczyć optymalną początkową gęstość wysiewu. - Dodać 500 μL zawiesiny komórkowej (2,5 x 104 komórek) do komór apikalnych.
- Dodać 750 μL chemoatraktanta (5% FBS w DMEM) do każdej z komór bazalnych, korzystając z portów próbkowych w celu uzyskania dostępu.
- Inkubować system BD BioCoat Tumor Invasion System oraz niepowlekaną płytkę wkładkową BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate przez 20-22 godziny w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2.
- Po inkubacji ostrożnie usunąć medium z komór apikalnych. Można to zrobić, wylewając zawartość do pojemnika na odpady. Nie dotykać dolnej powierzchni systemu wkładkowego.
- Przenieść system wkładkowy do drugiej płytki 24-dołkowej zawierającej 500 μL/studnię roztworu 4 μg/mL Calcein AM w HBSS. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, 5% CO2. Roztworu Calcein AM nie usuwa się z dolnej komory przed odczytem fluorescencji, ponieważ jest to niewykazujący fluorescencji barwnik witalny, który jest przekształcany w zieloną fluorescencyjną kalceinę przez esterazy cytozolowe.
- Fluorescencję komórek, które dokonały inwazji, odczytuje się przy długościach fal 494/517 nm (Ex/Em) za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek z odczytem od dołu. Wartość wzmocnienia (gain) może wymagać empirycznego ustalenia, jednak średnia wartość wzmocnienia powinna być wystarczającym punktem wyjścia. Zbyt wysokie ustawienie wzmocnienia może prowadzić do nasycenia detektora w przypadku próbek o silnej fluorescencji, co może uniemożliwić uzyskanie wiarygodnych wyników. Nie zaleca się stosowania funkcji autogain (jeśli jest obsługiwana przez czytnik). Do weryfikacji wyników można użyć odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego; jest to szczególnie pomocne przy pierwszym wykonaniu tego testu.
Uwaga: Jest niezwykle ważne, aby odczyty z systemów wkładkowych były wykonywane przy użyciu poprawnego mapowania płytki. Informacje na temat ładowania map płytek znajdują się w biuletynie technicznym BD nr 436 na stronie www.bdbiosciences.com lub można skontaktować się z pomocą techniczną BD (labware@bd.com). Prawidłowa orientacja płytki to studnia A1 w lewym górnym rogu i logo BD Falcon skierowane w prawo podczas wsuwania płytki do czytnika.
Redukcja danych
Dane przedstawiono w następującym równaniu:
Tło można odjąć przed obliczeniem procentowej inwazji komórek
RFU = względne jednostki fluorescencji.
Oświadczenia
Autorzy są pracownikami firmy BD Biosciences, która produkuje odczynniki i narzędzia wykorzystane w niniejszym artykule.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System Inwazji Guzów BD BioCoat | BD Biosciences | 354165 lub 354166 | |
| komórki HT-1080 i NIH/3T3 | ATCC | ||
| Dulbecco’podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium; bezsurowicze) | |||
| Dulbecco’bufor fosforanowy z solą, bez wapnia i magnezu (DPBS) | |||
| System wkładkek 24-dołkowych BD Falcon FluoroBlok do zastosowania jako kontrola migracji komórek | BD Biosciences | 351157 lub 351158 | |
| 5% płodowa surowica bydlęca w DMEM | |||
| Barwnik fluorescencyjny BD Calcein AM | BD Biosciences | 354216 lub 354217 | |
| Hanks’ Zrównoważony roztwór soli (HBSS) | |||
| płytki BD Falcon z 24 dołkami do znakowania po inwazji komórek | BD Biosciences | 351147 | |
| Fluorescencyjny czytnik płytek z możliwością odczytu od dołu | PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar. |
Bibliografia
- Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation. Blood. 109, 2727-2735 (2007).
- Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion. J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).
- Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells. Blood. , 113-2003 (2009).
- Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion. J. Immunol. , 177-5612 (2006).
- Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).
- An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. , 6,740,501,B2 (2004).
- Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds. Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).
- Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).
- Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).
Przedruki i uprawnienia
